Enzymes de Restriction et de modification Année universitaire 2015/2016 DR. OULDJAOUI AHMED.

Présentation au sujet: "Enzymes de Restriction et de modification Année universitaire 2015/2016 DR. OULDJAOUI AHMED."— Transcription de la présentation:

1 Enzymes de Restriction et de modification Année universitaire 2015/2016 DR. OULDJAOUI AHMED

2 1. Définition Ce sont des enzymes, principalement d’origine bactérienne, capables de couper l’ADN double brin (et ce quelque soit son origine) à des endroits spécifiques (séquences nucléotidiques) appelés sites de restriction généralement de 4 à 6 paires de bases.

3 2. La coupure ou phénomène de restriction Le phénomène de restriction a été observé bien avant que les enzymes de restriction ne fussent mises en évidence. En effet, lorsqu’un bactériophage colonise une bactérie, le phénomène de lyse bactérienne, après multiplication du phage par le biais de la machinerie enzymatique de la bactérie hôte peut ne pas avoir lieu. Ceci est expliqué par le fait que : 1.l’ADN phagique est intégré, sous forme silencieuse, dans celui de la bactérie : cycle lysogénique. 2.l’ADN phagique est complètement détruit (hydrolysé) par les enzymes de la bactérie hôte : les enzymes de restriction (Werner Arber).

4 3. Nomenclature des enzymes de restriction  La première lettre, en majuscule, représente l’initiale du genre bactérien.  Les deux lettres, minuscules, qui suivent la première sont représentatives de l’espèce.  Le chiffre romain qui suit ces trois lettres est le numéro d’ordre de découverte de l’enzyme pour la même bactérie source.  La dernière lettre majuscule n’est pas obligatoire pour toutes les endonucléases de restriction. Elle est représentative de la souche de la bactérie d’où l’enzyme a été isolée.

5 ENZYMES DE RESTRICTION A - NOMENCLATURE Escherichia coli Ry13 Eco R I 1 ière enzyme trouvée chez E coli Eco R V 5 ième enzyme trouvée chez E coli Providencia Stuarti Pst I

6 B - LES SEQUENCES RECONNUES : palindromiques COUPURES A BOUTS COHESIFS Ex : EcoR I 5 ’……G A A T T C …….3 ’ 5 ’……. G AATTC……3 ’ 3 ’……C T T A A G …….5 ’ 3 ’……..CTTAA G……5 ’ COUPURES A BOUTS FRANCS ex : Sma I (BLUNT ENDS) 5 ’……C C C G G G……3 ’ 5 ’ ….C C C G G G…3 ’ 3 ’…....G G G C C C……5 ’ 3 ’ ….G G G C C C....5 ’

7

8 EXEMPLE : COUPURE PAR EcoRI EcoRI NNGAATTCNN NNCTTAAGNN NNG OH p AATTCNN NNCTTAA p OH GNN

9 SITES METHYLES Sau 3A site contenu dans Bam HI : sites compatibles …...G A T C……. …...G G A T C C……. …...C T A G……. ……C C T A G G…... SITES INCLUS ADN des eucaryotes peut être méthylé au niveau des cytosines CpG. Certaines enzymes ne reconnaissent pas l’ADN méthylé C CG G G GC C C CG G G GC C MspI ne coupe pasHpa II coupe MspI et HpaII sont appelés des isoschizomers

10 EnzymeOrganism from which derivedTarget sequence (cut at *) 5' -->3' Ava IAnabaena variabilisC * C/T C G A/G Bam HIBacillus amyloliquefaciens * G A T C C Bgl IIBacillus globigiiA* G A T C T Eco RIEscherichia coli RY 13 G * A A T T C Eco RIIEscherichia coli R245* C C A/T G G Hae IIIHaemophilus aegyptiusG G * C C Hha IHaemophilus haemolyticusG C G * C Hind III Haemophilus inflenzae RdA* A G C T T Hpa IHaemophilus parainflenzaeG T T * A A C Kpn IKlebsiella pneumoniaeG G T A C * C Mbo IMoraxella bovis* G A T C Pst IProvidencia stuartii C T G C A * G Sma ISerratia marcescensC C C * G G G Sst IStreptomyces stanfordG A G C T * C Sal IStreptomyces albus GG * T C G A C Taq IThermophilus aquaticusT * C G A Xma IXanthamonas malvacearumC * C C G G G Sites = 4 à 6 pbases Coupure fréquente ~ 3kb Sites = 8 pbases Coupure rare ~ 100 - 200kb

11 Visualisation des fragments de restriction (électrophorèse) Après coloration au BET

12 ADN génomique non coupé ADN génomique coupé ADN de phage (50kb) coupé

13 Nombre de kb (échelle Log) Migration mm

14 10 kb 7 kb 3 kb 8 kb 2 kb 5 kb 3 kb 2 kb ENZYME Eco RI ENZYME Hind III ENZYMES Eco RI + Hind III EcoRIHind III 3kb5kb2kb CARTE DE RESTRICTION

15 AUTRES ENZYMES - Les polymérases - L’ADN polymérase I - Le fragment de Klenow de la Pol I - La Taq polymérase - Les ARN polymérases - La transcriptase réverse - Les ligases (ADN ligase, T4 DNA ligase), nucléases (DNASe I, nucléase S1).

16 La ligation (ligature...) Une enzyme, la ligase, est capable de lier de façon covalente deux molécules d’ADN en une.

17 MERCI POUR VOTRE ATTENTION