Biochimie structurale

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1 Biochimie structurale
Chapitre 1 Titre Biochimie structurale 2ème partie Les protéines

2 plan 1.1-1.3 4. Structure tertiaire. 1. Propriétés des acides aminés.
1.1. Représentation et isomérie. 4.1. Organisation. 4.2. Méthode d’étude. 1.2. Polarité des chaînes latérales. 4.3. Protéines globulaires. 1.3. pHi. 4.4. Protéines membranaires. 2. Structure primaire. * Structure de la membrane plasmique. 2.1. Liaison peptidique. * La membrane du GR. 2.2. Séquence. * Types d’interactions. 3. Structure secondaire. * Exemple: un canal ionique. 3.1. Liaisons de faible énergie. * Exemple: une porine. 3.2. Structures. 4.5. Protéines fibreuses. 4.6. Pliage et dénaturation. * Dénaturation et renaturation spontanée. * Les protéines HSP. * Cas des prions.

3 Cette propriété est due à la présence d’un carbone asymétrique.
1. Propriétés des acides aminés. 1.1. Représentation et isomérie. Cette propriété est due à la présence d’un carbone asymétrique. Un acide aminé est constitué par un carbone (appelé carbone a) relié à 4 groupements différents. carbone asymétrique 1.1.1 repr AA R chaîne latérale Il a la forme d’un tétraèdre. La molécule ne possède qu’un seul carbone asymétrique. C H Les acides aminés existent sous deux formes. COO- NH3+ Il existe une symétrie entre les deux: ce sont des stéréo-isomères. fonction carboxyle fonction amine R R Elles sont images l’une de l’autre dans un miroir: on parle d’énantiomères. Représentation de Cram. C C Fisher a mis au point une méthode pour représenter les molécules qui tient compte de l’isomérie. H H COO- COO- NH3+ NH3+ PLAN 03

4 1.1.1 repr AA R 1.1. Propriétés des acides aminés. C H COO- NH3+ R R
1.1. Représentation et isomérie. Règles de la représentation de Fisher 1.1.1 repr AA R * Représentation et isomérie. 1.1. Propriétés des acides aminés. La chaîne carbonée principale (la plus longue) est représentée par un trait vertical. chaîne latérale Les H ne sont pas représentés. C H L’extrémité portant la fonction la plus oxydée est située en haut. COO- NH3+ Le groupement OH (ou NH) du carbone asymétrique est orienté vers l’observateur et est situé à droite pour les séries D et à gauche pour les séries L. fonction carboxyle fonction amine R R COO- NH3+ COO- NH3+ On peut représenter tous les acides aminées par cette technique. C C forme L forme D H H COO- COO- NH3+ NH3+ PLAN 04

5 1.1.1 liste AA PLAN 05 Acides aminés à chaîne latérale aliphatique.
Représentations dérivées de la représentation de Fisher. 1.1.1 liste AA Acides aminés à chaîne latérale aliphatique. Acides aminés à chaîne latérale aromatique. PLAN 05

6 1.1.1 liste AA PLAN 06 Acides aminés à chaîne latérale chargée.
Acides aminés à chaîne latérale soufrée. Acides aminés à chaîne latérale à amide. PLAN 06

7 Les Anglo-saxons utilisent un système d’abréviations
à une lettre. 1.1.1 Abrèv AA PLAN 07

8 1.1.2 polarité PLAN 08 1. Propriétés des acides aminés.
1.2. Polarité des chaînes latérales. La nature des chaînes latérales influence le comportement de l’acide aminé dans son environnement. 1.1.2 polarité Chaînes hydrophiles, solubles Forment des liaisons ioniques: -----> conformation de la protéine -----> implication dans les réactions chimiques Groupements chargés Chaînes hydrophiles, solubles Tendent vers une charge partielle (liaisons H): -----> conformation de la protéine -----> implication dans les réactions chimiques -----> association avec les molécules d’eau (solubilité) Groupements polaires non chargés Chaînes hydrophobes Pas d’interaction avec le milieu aqueux -----> au cœur des protéines solubles -----> protègent le site catalytique de l’intrusion de l’eau -----> association avec les membranes Groupements non polaires PLAN 08

9 1.1.2 polarité PLAN 09 1. Propriétés des acides aminés.
1.2. Polarité des chaînes latérales. Cas particuliers 1.1.2 polarité Chaîne latérale = H Adapté à milieu hydrophile et hydrophobe. Gly se trouve aux endroits où deux polypeptides sont en contact étroit (Collagène) Glycine (Gly) Le S de la chaîne latéral est capable de former une liaison covalente avec le S d’une autre Cys. Formation d’un pont disulfure. Cystéine (Cys) La structure cyclique de la chaîne latérale lui permet de former des boucles dans les chaînes peptidiques. Perturbe la structure secondaire. Proline (Pro) PLAN 09

10 Le pH modifie l’état d’ionisation des fonctions acido-basiques.
1. Propriétés des acides aminés. PLAN 10 1.3. pHi. 1.1.3 pH Le pH modifie l’état d’ionisation des fonctions acido-basiques. pH Neutralisation 2 Il existe une valeur de pH pour laquelle la charge globale de la molécule est neutre. pHi COO- NH2 Demie neutralisation Globalement - pKa2 Globalement neutre Neutralisation 1 COO- NH3+ Cette valeur est importante pour déterminer le pH des tampons utilisés pour les électrophorèses. Demi neutralisation pKa1 COOH NH3+ Globalement + V base ajoutée

11 1.1.3 pH PLAN 11 1. Propriétés des acides aminés. 1.3. pHi. AA pKa Asp
4,7 Glu His 6,5 Lys 10,2 Arg 12 PLAN 11

12 1.1.3 pH PLAN 12 1. Propriétés des acides aminés. 1.3. pHi.
Ce n’est pas si simple que ça! 1.1.3 pH Le pHi se calcule à partir des pKa des différents groupes acido-basiques. Il faut connaître les pKa des fonctions terminales. Pour une grande protéine, leur influence est négligeable devant la quantité de chaînes latérales. Il faut connaître les pKa des chaînes latérales. Cas d’un groupement unique: pHi = pKa Cas de 2 groupements : pHi = (pKa1 + pKa2)/2 Cas de plusieurs groupements : pHi = moy (pKa) La présence des autres acides aminés influence le comportement des fonctions acido-basiques. Et là, ça ne marche plus! PLAN 12

13 1.1.3 pH PLAN 13 1. Propriétés des acides aminés. 1.3. pHi.
La présence des autres acides aminés influence le comportement des fonctions acido-basiques. PLAN 13

14 1.2.1 liais pept PLAN 14 2. Structure primaire.
2.1. Liaison peptidique. 1.2.1 liais pept Formation de la liaison Caractéristiques de la liaison Succession de liaisons peptidiques dans une protéine. déshydratation Rotation et organisation dans l’espace. PLAN 14

15 Cas des modifications post transcriptionnelles:
2. Structure primaire. 2.2. Séquence. 1.2.2 seq Il s’agit de l’ordre des acides aminés dans la protéine. NH3+ - His - Leu – Ile – Asp – Pro – Tyr – Phe – Phe - ... H – L – I – D – P – Y – F – F - ... Cas des modifications post transcriptionnelles: On trouve dans les protéines un certain nombre d’autres acides aminés qui résultent de l’altération des chaînes latérales des 20 AA de base après leur incorporation dans la chaîne protéique. Incorporation d’un phosphate à une Ser, Thr ou Tyr. D interaction avec d’autres protéines. D durée de vie dans la cellule. Une erreur peut être à l’origine d’un cancer. PLAN 15

16 1.2.2 seq PLAN 16 2. Structure primaire. Détermination des séquences.
Détermination de la composition. hydrolyse de la protéine 110°C, HCl 6 mol.L-1 pendant 24h chromatographie d’échange d’ions révélation par ninhydrine fluorescamine interprétation: Réagit avec les amines en bleu avec les imines (Pro) en jaune Réagit avec les amines en donnant un produit fluorescent (très sensible) On identifie les AA en fonction de leur volume d’élution. dans ce cas le peptide contient: Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe PLAN 16

17 Détermination des séquences. Détermination de la composition.
2. Structure primaire. Détermination des séquences. 2.2. Séquence. 1.2.2 seq Détermination de la composition. Spectrométrie de masse. PLAN 17

18 Détermination des séquences. Détermination de l’extrémité N-terminale.
2. Structure primaire. Détermination des séquences. 2.2. Séquence. 1.2.2 seq Détermination de l’extrémité N-terminale. Méthode de Sanger Fixation sur la fonction amine terminale d’un réactif. Hydrolyse du peptide. Identification par chromatographie. F F -- NH H2N Ala Gly Asp Phe Arg Gly Remarque: cette méthode ne peut pas être utilisée de façon répétitive car le peptide est hydrolysé totalement. PLAN 18

19 1.2.2 seq PLAN 19 2. Structure primaire. Détermination des séquences.
Détermination de la séquence. Méthode d’Edman Fixation sur la fonction amine terminale d’un réactif. Hydrolyse douce du premier AA. Identification par chromatographie. NH – C – NH S N = C = S H2N Ala H2N Gly Asp Phe Arg N = C = S Remarque: Il suffit de recommencer pour déterminer la séquence. PLAN 19

20 1.3.1 faible Eg H O -- N -- H O -- H O -- NH3+ -OOC -- force = d+.d-
3. Structure secondaire. 3.1. Liaisons de faible énergie. Forces de Van der Waals 1.3.1 faible Eg Liaisons hydrogène. H O Lorsqu’ils sont très proches, deux atomes développent une interaction de liaison faible due à la fluctuation de leurs charges électriques. L’eau fait compétition avec les liaisons hydrogène. -- N -- H O -- 0,1 nm 0,2 nm Eg répulsion attraction distance entre les atomes r éq (nm) H 0,12 C 0,20 N 0,15 O 0,14 équilibre Liaisons ioniques. H O Ici aussi, l’eau fait compétition avec les liaisons. -- NH3+ -OOC -- d+ d- force = d+.d- r2D loi de Coulomb Deux atomes sont attirés l’un par l’autre jusqu’à ce que la distance qui les sépare soit égale à la somme de leurs rayons de VdW D = cte diélectrique = 1 pour le vide = 80 pour l’eau PLAN 20

21 1.3.2 struct sec a C O H N PLAN 21 3. Structure secondaire.
Il existe trois types d’organisations spatiales au sein des protéines. 3.2. Structures. 1.3.2 struct sec a Hélice a La chaîne peptidique est enroulée sur elle-même et les chaînes latérales sont disposées à l’extérieur de façon hélicoïdale à la manière d’un escalier en colimaçon. C O L’hélice est stabilisée par des liaisons hydrogène entre les groupes NH du résidu n avec les groupes NH des résidus n+4 H N La proportion d’hélice est très variable d’une protéine à l’autre: myoglobine > 60 % chymotrypsine = 0 % 3,6 AA par tour 15 nm de translation entre deux AA PLAN 21

22 Il existe trois types d’organisations spatiales
3. Structure secondaire. Il existe trois types d’organisations spatiales au sein des protéines. 3.2. Structures. 1.3.2 struct sec b Feuillet b La chaîne peptidique est totalement étirée (distance axiale entre AA adjacents = 35 nm). La structure est rigide et résiste à l’étirement. La structure est stabilisée par des liaisons H entre CO et NH de chaînes différentes. La soie est constituée presque exclusivement de feuillet b Les chaînes peuvent être dans le même sens (parallèles) ou en sens inverse (antiparallèles). Le 3ème type d’organisation, l’hélice de collagène, est étudiée plus loin. Les chaînes peuvent changer brusquement de direction et former des coudes. Le groupe CO d’un AA en position n forme une liaison H avec le NH d’un AA en position n+4 PLAN 22

23 1.4.1 struct tert PLAN 23 4. Structure tertiaire.
C’est une représentation de la conformation de l’ensemble de la protéine. 4.1. Organisation. 1.4.1 struct tert Cette conformation est stabilisée par une série de liaisons non covalentes entre les différentes chaînes latérales de la protéine. PLAN 23

24 1.4.2 méth étude PLAN 24 4. Structure tertiaire.
On détermine la structure tertiaire d’une protéine par cristallographie aux rayons X. 4.2. Méthode d’étude. 1.4.2 méth étude On bombarde un cristal de protéine par un mince faisceau de rayons X. Le rayonnement est dispersé (difracté) par les atomes de la protéine et frappe une plaque sensible au rayonnement (détecteur). On effectue une analyse mathématique complexe de l’image et on en déduit l’organisation des atomes. détecteur émetteur de rayons X protéine cristallisée PLAN 24

25 75% de la myoglobine est formé d’hélice a.
4. Structure tertiaire. 4.3. Protéines globulaires. 1.4.3 prot glob Les protéines globulaires ont une forme compacte qui résulte de nombreux « pliages » et torsion. Des acides aminés éloignées sur la séquences se retrouvent à proximité et peuvent participer à la même activité (reconnaissance d’un ligand, centre catalytique, fixation d’un groupement prosthétique...) Myoglobine 75% de la myoglobine est formé d’hélice a. La chaîne est repliée sur elle-même pour délimiter une poche hydrophobe où l’hème est à l’abri de l’oxydation et peut fixer l’O2. PLAN 25

26 1.4.3 prot glob PLAN 26 4. Structure tertiaire.
4.3. Protéines globulaires. La plupart des protéines globulaires sont composées de plusieurs modules distincts qui se replient indépendamment et possèdent des fonctions autonomes: les domaines. 1.4.3 prot glob domaines 2 Phospholipase C domaines 1 domaines 3 domaines 4 Les domaines proviennent sans doute de gènes indépendants qui ont fusionné au cours de l’évolution. On les retrouve dans d’autres protéines PLAN 26

27 1.4.4 prot mbr PLAN 27 4. Structure tertiaire.
4.4. Protéines membranaires. 1.4.4 prot mbr Une partie structurale: la bicouche lipidique. La membrane plasmique est composée de deux parties: Une partie fonctionnelle: les protéines constitutives. La majeur partie de la double couche est constituée de phospholipides. acide gras CH3 – (CH2)n - COOH glycérol phosphate PLAN 27

28 1.4.4 prot mbr PLAN 28 4. Structure tertiaire.
4.4. Protéines membranaires. La membrane du globule rouge en est l’exemple type. C’est l’une des plus étudiée. 1.4.4 prot mbr La membrane contient de très nombreuses protéines. Protéines périphériques (extrinsèques) GR Ghost Squelette interne de la membrane Protéines internes (intrinsèques) SDS-PAGE PLAN 28

29 1.4.4 prot mbr PLAN 29 4. Structure tertiaire.
4.4. Protéines membranaires. Les protéines sont fixées à la membranes par divers types d’interactions. 1.4.4 prot mbr Les interactions avec la membrane sont relativement faibles. On peut les séparer par modification de la force ionique ou du pH. Protéines périphériques (extrinsèques) Avec les glycolipides. Liaisons covalentes Pont disulfure avec les protéines intégrées Avec les têtes des phospholipides. Liaisons non covalentes Avec les protéines intégrées Interactions hydrophobes Avec les protéines intégrées PLAN 29

30 1.4.4 prot mbr + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
* Un exemple de fonction: la pompe Na;K, ATPase. On mesure la différence de charge de part et d’autre de la membrane.. 1.4.4 prot mbr La présence des protéines perturbe la répartition des ions. Réf Ind Oscilloscope La pompe Na, K, ATP ase est à l’origine d’un différentiel Na, K. -85 mV K+ K+ Na+ Na+ Electrodes Na+ K+ K+ LEC ATP ATP ADP ADP Prot- K+ LIC On parle de gradient électrochimique. Na+ Na+ K+ Prot- Prot- K+ K+ PLAN 30

31 changement de conformation changement de conformation
* Un exemple de fonction: la pompe Na;K, ATPase. L’hydrolyse de l’ATP induit un changement de conformation de la pompe qui permet la translocation de l’ion. 1.4.4 prot mbr K+ K+ changement de conformation LEC changement de conformation Remarquer le déséquilibre ionique provoqué par la pompe: sortie de 3 Na+ pour une entrée de K+. L’intérieur de cellule est bien négative par rapport à l’extérieur. LIC P ADP Na+ Na+ ATP Na+ PLAN 31

32 * Un exemple de fonction: la pompe Na;K, ATPase.
1.4.4 prot mbr Le transport des ions se produit du compartiment le moins concentré vers le plus concentré. (Les biochimistes disent « contre le sens du gradient » Le transport est possible grâce à un apport extérieur d’énergie (dans ce cas l’hydrolyse de l’ATP) Ces deux propriétés sont caractéristiques d’un transport actif. débit ionique gradient On peut bloquer l’activité ATPase grâce à une toxine, la oubaïne. + oubaïne PLAN 32

33 * Un autre exemple de fonction: le canal ionique de l’axone.
Structure du canal K+ voltage dépendant 1.4.4 prot mbr Boucles extracellulaires Protéines intégrées (intrinsèques) Domaine du pore Domaine sensible au voltage Les segments intra-membranaires sont des hélices a. Les chaînes latérales des hélices sont orientées vers l’extérieur. Boucles intracellulaires En contact avec la membrane (queues aliphatiques): AA non polaires En contact avec le milieu aqueux (LIC, LEC, pore): AA polaires et/ou chargés PLAN 33

34 1.4.4 prot mbr + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
* Un autre exemple de fonction: le canal ionique de l’axone. Fonctionnement du canal 1.4.4 prot mbr au repos Remarque: le canal se referme automatiquement après un délais précis. Arrivée d’une dépolarisation ouverture Ce transport utilise une enzyme. C’est une diffusion facilité. La ouabaïne n’a aucun effet. débit ionique gradient Les ions passent dans le milieu le moins concentré. (dans le sens du gradient) Le nouveau champ électrique « tord » les chaînes d’AA polaires et change la conformation de la protéine. Il nécessite aucun apport d’énergie extérieur. Une modification de quelques millivolts à quelques nm de distance équivaut à un choc électrique de plusieurs centaines de volts. On parle de transport passif ou diffusion. K+ PLAN 34

35 1.4.4 prot mbr + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
* Un autre exemple de fonction: le canal ionique de l’axone. PLAN 35 Les forces de la diffusion 1.4.4 prot mbr Na+ Na+ Na+ Les deux se renforcent K+ K+ Les deux se neutralisent Les ions sont soumis à 2 forces K+ * Le gradient de concentration * Le gradient électrique. L’intensité et la direction des mouvements ioniques dépendent de ces deux facteurs. Ils interviennent dans la valeur des potentiels ioniques.

36 1.4.4 prot mbr + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
* Un autre exemple de fonction: le canal ionique de l’axone. Les potentiels ioniques 1.4.4 prot mbr Chaque ions possède un potentiel ionique donné par l’équation de Nernst. E = 58 log 20 = + 51 mV 140 E = R.T Ln Cext n.F Cint Na+ R: constante des gaz parfaits (8,3145 J.mol-1.K-1). T: température en K (298 K) z: valence de l’ion F:Faraday ( Coulombs.mol-1) E = 58 log 150 = - 97 mV 4 E = 58 log Cexr Cint K+ Ce potentiel est également appelé potentiel d’équilibre de l’ion. Il correspond au potentiel de la membrane pour lequel il est à l’équilibre (sa diffusion est nulle). PLAN 36

37 1.4.4 prot mbr + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
* Un autre exemple de fonction: le canal ionique de l’axone. Les potentiels ioniques 1.4.4 prot mbr ENa = + 51 mV EK = - 97 mV Na+ ENa éloigné de Emb Na+ « veut » passer Au repos; Emb = - 85 mV Ek proche de Emb K+ K+ n’a pas tendance à diffuser. PLAN 37

38 1.4.4 prot mbr - - - - - - - - - - - - - - - - -
* Un autre exemple de fonction: le canal ionique de l’axone. Le potentiel d’action 1.4.4 prot mbr ENa = + 51 mV EK = - 97 mV Na+ ENa éloigné de Emb Na+ « veut » passer Au repos; Emb = - 85 mV dépolarisation Emb > Ek éloigné de Emb Ek proche de Emb K+ K+ n’a pas tendance à diffuser. K+ a tendance à diffuser. Arrivée d’une dépolarisation Entrée de Na+ Sortie K+ PLAN 38 Retour au potentiel de repos.

39 1.4.4 prot mbr PLAN 39 Couronne de feuillet b
* Exemple: une porine. 1.4.4 prot mbr Couronne de feuillet b porine Protéines intégrées (intrinsèques) membrane externe Ils peuvent être également des feuillets b Les segments intra-membranaires sont des hélices a. peptidoglycane membrane interne Membrane d’une bactérie Gram- PLAN 39

40 Les protéoglycanes se trouvent dans la matrice extracellulaire.
4. Structure tertiaire. 4.5. Protéines fibreuses. Les protéines fibreuses possèdent une conformation et une séquence monotone. 1.4.5 prot fibreuse Les protéoglycanes se trouvent dans la matrice extracellulaire. molécule protéique axiale. chaînes de différents glycosaminoglycanes en proportion variable. PLAN 40

41 1.4.5 pliage sp PLAN 41 4. Structure tertiaire.
4.6. Pliage et dénaturation. L’activité d’une protéine dépend totalement de sa conformation. * Dénaturation et renaturation spontanée. 1.4.5 pliage sp Le processus de « pliage » doit être rigoureux et reproductible. Processus spontané. Cas de la renaturation de la ribonucléase. élimination des facteurs de dénaturation dénaturation réduction des ponts diS détergent solvants orga radiations Phénomène thermodynamique: la conformation native correspond au niveau de plus faible énergie. 124 AA chaleur 4 ponts diS urée b mercaptoéthanol PLAN 41

42 Protéines chaperonnes
4. Structure tertiaire. Ces protéines apparaissent dans la cellule en cas de stress du des températures élevées (protéine de choc thermique = heat-shock protein = HSP) à l’origine de dénaturation. 4.6. Pliage et dénaturation. * Les protéines HSP. 1.4.5 pliage HSP Protéines chaperonnes Plusieurs protéines (HSP70) aident les protéines non ou mal repliées à atteindre leur conformation correcte. Elles s’unissent à de courts segments d’acides aminés hydrophobes qui devraient être masquées si la protéine était en conformation native. « Moi aussi, ça me chiffonne de les voir repliées! » PLAN 42

43 1.4.5 prion PLAN 43 4. Structure tertiaire.
Les prions anormaux agissent comme des agents infectieux (Creutzfeld-Jacob, encéphalopathie spongiforme,…) Protéines existant sous deux conformations et possédant des propriétés physiques différentes. 4.6. Pliage et dénaturation. * Cas des prions. 1.4.5 prion Protéine Prion Scrapie (tremblante du mouton) Protéine Prion Cellulaire Forme normale PrPc Forme pathologique PrPSc En présence de la forme anormale, les prions cellulaires sont progressivement transformés en forme anormale à la suite d’une réaction en chaîne. Présence de deux hélices a et d’un feuillet b Présence de trois hélices a Cette polymérisation est létale. Un phénomène voisin (il ne s’agit pas de prion) se déroule au cours de la maladie d’Alzheimer. Une protéine tronquée forme des fibrilles insolubles. Polymérisation spontanée en fibrilles insolubles. Résistant aux protéases. Monomère soluble. Sensible aux protéases. PLAN 43