Précipitation immunologique

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1 Précipitation immunologique
Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

2 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND
Deux formes d’antigènes (Ag) Précipitation Ag solubles Ag particulaires Particule Ag Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

3 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND
Propriétés de l’anticorps (Ac) précipitant reconnaissance spécifique de l’Ag liaison à l’antigène soluble créant un réseau non soluble précipitant dans les conditions optimales* Classes d’anticorps : IgM ou IgG ; Conditions physicochimiques de température, de concentration ionique ; Concentrations d’antigène et d’anticorps à l’équivalence. Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

4 Formation de complexes immuns s’associant en réseau
Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

5 Différents types de précipitation
En milieu liquide Dépôt des deux solutions l’une au dessus de l’autre -> Réaction à l’interface Mélange des deux solutions -> Taille faible des immuns complexes analysés en photométrie (absorption ou diffraction) En milieu gélifié Support = gel d’agarose dont les mailles laissent passer les molécules qui diffusent retiennent les réseaux qui s’accumulent -> Précipités visibles sous forme de traits blanchâtres Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

6 Différents types de précipitation
En milieu liquide En tube Dépôt des deux solutions l’une au dessus de l’autre Solution antigénique Solution d’anticorps Apparition d’un anneau diffus de précipité à l’interface dans la zone d’équivalence Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

7 Différents types de précipitation
En milieu liquide En flux Mélange des deux solutions Mesure du faisceau après absorption : TURBIDIMETRIE Faisceau lumineux Faisceau transmis Faisceau diffracté Mesure du faisceau après diffraction : NEPHELEMETRIE Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

8 Différents types de précipitation
En milieu gélifié Type agarose composé de deux phases liquide permettant la diffusion des molécules créant un gradient de concentration à partir du point de dépôt solide, ensemble de mailles immobilisant des réseaux de précipités Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

9 Différents types de précipitation
En milieu gélifié (agarose) Diffusion double : Deux gradients de concentration à partir des points de dépôt des Ag et des Ac Apparition du réseau de précipité en un point situé entre les deux dépôts à l’équivalence Diffusion simple : Un seul gradient de concentration à partir du point de dépôt de l’un des constituant (Ag) l’autre (Ac) étant contenu dans la gélose Apparition du réseau de précipité autour du puits à l’équivalence Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

10 Diffusion double en milieu gélifié Technique d’Ouchterlony
Couler un gel d’agarose neutre maintenu en surfusion dans une petite boite de Pétri ou sur une lame. Perforer à l’aide d’emporte pièce la gélose afin de créer des puits judicieusement placés. Déposer dans le puits central un antisérum dans les puits périphériques des antigènes ou inversement antigène dans un puits central et différents antisérums dans les puits périphériques. Laisser diffuser 24 à 48 heures. Observer les arcs apparus. Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

11 Diffusion double en milieu gélifié Technique d’Ouchterlony
Résultats Puits central : antisérum humain 1 : sérum humain 2 : albumine humaine 1 2 3 : IgG 4 : IgG 3 4 Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

12 Diffusion double en milieu gélifié Technique d’Ouchterlony
Interprétation 6 arcs entre le puits 1 et le puits central = présence de nombreux Ag dans le sérum humain entre autres : Albumine révélée par la fusion avec l’arc entre le puits central et le puits 2 IgG révélée la fusion avec l’arc entre le puits central et les puits 3 2 1 3 Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

13 Diffusion double en milieu gélifié Technique d’Ouchterlony
Interprétation Identité complète entre les antigènes identifiés Fusion entre les arcs de deux puits adjacents Absence d’identité entre les antigènes identifiés Croisement net de ces arcs Identité partielle entre les antigènes Éperon entre deux arcs de puits adjacents Exemple : Puits central : antiIgG humaine et bovine Puits 5 : IgG humaine Puits 6 : IgG bovine 5 Année 2008 6 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

14 Diffusion simple en milieu gélifié Technique de Mancini
Couler un gel d’agarose maintenu en surfusion dans une petite boite de Pétri ou sur une lame en y incorporant la solution d’anticorps. Perforer à l’aide d’un emporte pièce la gélose afin de créer des puits. Déposer dans les puits différentes dilutions de la solution étalon de l’antigène puis les antigènes inconnus Laisser diffuser 24 à 48 heures. Analyser les disques de précipité apparus. Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

15 Diffusion simple en milieu gélifié Technique de Mancini
Mesure des diamètres des anneaux de précipité 1 Puits ρ g/L D mm D2 mm2 1 4 17 289 2 3 15 225 12 144 9 81 5 12,5 156 6 8,5 73 7 25 8 49 8 2 3 7 4 6 5 Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

16 Diffusion simple en milieu gélifié Technique de Mancini
5 6 7 8 2,07 Tracé de la droite D2 = f([ρ]) 1 0,25 0,6 Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

17 Diffusion accélérée ou Immunoélectrodiffusion
En milieu gélifié Nécessité d’un tampon présent dans la phase liquide du gel et les deux côtés de la cuve où plongent les électrodes fortement ionisé pour conduire le courant électrique de pH adapté aux molécules afin qu’elles migrent plus rapidement vers l’électrode complémentaire Migration des molécules sous l’effet d’un courant électrique créant un gradient de concentration dirigé. Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

18 Immunoélectrodiffusion double Technique de l’électrosynérèse
Sens des électrons Installation du gel dans la cuve avec des ponts plongeant dans le tampon présent dans des deux côtés de la cuve où se situent les électrodes avec positionnement des puits antigènes (chargés négativement) à la cathode et anticorps à l’anode. Application d’un courant pour accélérer la diffusion naturelle Migration rapide des antigènes vers l’anode des anticorps vers la cathode. Formation d’un trait de précipitation à l’équivalence. Ac Ag + - Ac Ag Ac Ag1/2 Ag1/4 Ac + - Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND Sens des électrons

19 Immunoélectrodiffusion double Technique de l’électrosynérèse
Résultats et interprétation A la sortie de la cuve de migration Après coloration au Bleu de toluidine Présence d’arcs indiquant la spécificité de l’Ac pour l’Ag Qualité des arcs variable en fonction de la concentration en antigène Épaisseur plus forte pour les concentrations les plus importantes Proximité plus grande du puits anticorps pour les concentration en Ag élevées. + - Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

20 Immunoélectrodiffusion simple Technique de Laurell
Installation du gel dans la cuve avec des ponts plongeant dans le tampon présent dans des deux côtés de la cuve où se situent les électrodes avec positionnement des puits antigènes à la cathode, la solution d’anticorps étant incorporé au gel. Application d’un courant pour accélérer la diffusion naturelle Migration des antigènes vers l’anode avec en même temps une diffusion radiale Formation d’une fusée (rocket) de précipitation à l’équivalence. Sens des électrons Ac Ag + - Ac Ag 1/2 Ag Ag1/4 + - Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND Sens des électrons

21 Immunoélectrodiffusion simple Technique de Laurell
Résultats et interprétation Après coloration au Bleu de toluidine Présence de fusées indiquant la spécificité de l’Ac pour l’Ag Hauteur des fusées variable en fonction de la concentration en antigène permettant une analyse quantitative avec Tracé de courbe h = f ([ρ]) à l’aide d’une gamme d’étalonnage Détermination de la concentration d’échantillons inconnus en fonction de la hauteur du pic obtenue par report sur la courbe + + - - Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

22 Électrophorèse préalable Immunoélectrophorèse
Sens des électrons Séparation électrophorétique du mélange antigénique par migration dans un gel imprégné de tampon avec ponts plongeant dans le tampon présent dans des deux côtés de la cuve où se situent les électrodes positionnement des puits antigènes à la cathode. Migration Dépôt des anticorps dans une gouttière parallèle au sens de migration. Diffusion double durant 24 à 48 h. Formation d’arcs de précipitation à l’équivalence à analyser. Ag + - + - Ac Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND

23 Électrophorèse préalable Immunoélectrophorèse
Résultats et interprétation d’une immunoélectrophorèse de sérum humain Après coloration au Bleu de toluidine, apparition de multiples arcs enchevêtrés correspondants aux nombreux antigènes présents dans le sérum humain dont IgG Transferrine Albumine humaine IgM Alpha1antitrypsine IgA + - Année 2008 Equipe pédagogique du lycée Jean Moulin (Angers) POCHET- DURAND