Analyse du risque : Détection des OGM par les méthodes sérologiques et moléculaires Meriem Louanchi Camilo Rodriguez-Beltran 5e Cours Régional sur « Les.

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1 Analyse du risque : Détection des OGM par les méthodes sérologiques et moléculaires Meriem Louanchi Camilo Rodriguez-Beltran 5e Cours Régional sur « Les fondements holistiques pour l’évaluation et la régulation du génie génétique et des OGM en Afrique ». Cotonou, Bénin, 3 au 15 décembre 2012

2 Méthodes de détection Bio Essais (herbicide sur feuille) Méthodes basées sur les protéines : – Essai enzymatique – Techniques immunologiques Méthodes basées sur les acides nucléiques – Hybridation directe (Southern, Northern macro / micro puces à ADN…) – Amplification de la cible ou du signal – Combinaison de toutes les techniques

3 Procédure générale de détection Échantillonnage / sous échantillonnage Broyage / homogénéisation / réduction Extraction des analytes Analyses (valeur standard, méthodes de validation) Résultats d’interprétation (standards, mesure d’erreur, contrôles…) et expression

4 Performances des méthodes de détection Sensibilité (limite de détection LOD, limite de quantification LOQ) Spécificité Exactitude Robustesse Précision Reproductibilité En sus: Applicabilité et praticabilité Développement et validation par des tests inter laboratoires

5 1. Méthodes basées sur les protéines

6 Transgènes codant de nouvelles protéines Techniques Immunoenzymatiques utilisant des anticorps – Idéal pour des analyses qualitatives – Détecte des protéines spécifiques dans des matrices complexes Anticorps polyclonaux – Sensible mais reconnaissance moins spécifique Anticorps Monoclonaux – Très spécifique, légèrement moins sensible Format gélifié :Western blot ELISA: Sandwich ELISA, ELISA sur bandelette 1.1. Présentation

7 Protéine “Antigène” cible Epitope Anticorps Fixation déterminée par ajustement 3-dimensionnel et interactions chimiques entre anticorps et antigènes Fixation des anticorps 1.1. Présentation

8 1.2. Western Blot Test qualitatif hautement spécifique Utilisation dans la recherche de nouvelles protéines Utilise les conditions dénaturantes SDS-PAGE Papier filtre Papier filtre humide Poids Membrane Les composants du gel sont transférés sur un support solide comme la membrane de nitrocellulose

9 1.2. Western Blot (Suite) Bloquer la membrane (Régilait) Ajouter les anticorps Fixation des anticorps avec les protéines Marquage de la fixation par une réaction colorée Ajouter le conjugué (anticorps couplé à une enzyme) Après l’ajout du substrat Les bandes colorées doivent être retrouvées sur le gel de départ Détection de la protéine CP4-EPSPS

10 1.2. ELISA sur plaque de microtitration Fixation des anticorps sur la plaque – Quantitative, hautement sensible, économique, idéal dans un laboratoire d’analyse – Protéines non dénaturées – Détecte 0,25% GMO graines, 1,4% pain puit Antigène Protéine blocage Conjugué (Anticorps couplé à une enzyme) Anticorps OGM specifique de l’antigène Réaction colorée dépendante de la concentration

11 Signal Couleur Fluorescence Protéine cible Reconnaissance Sites (Epitopes) Capture de l’Anticorps Détecteur de l’Anticorps 1.2. ELISA sur plaque de microtitration (Suite)

12 Quantification et détermination du seuil Intégration du contrôle qualité Résultats rapides Pas d’équipement trop spécialisé 1.2. ELISA sur plaque de microtitration (Suite) Détection de soja RR dans des échantillons alimentaires et quantification (Ghazi, 2007)

13 1.3. ELISA sur bandelettes Variation ELISA à l’aide de 2 anticorps immobilisés, spécifiques à la protéine transgénique, couplés à un réactif coloré et incorporé sur un papier filtre spécial. Rapide, économique et bon pour un screening initial

14 1.3. ELISA sur bandelettes (Suite) 1. Disque foliaire 2.Ajouter le tampon et broyer 3.Insérer la bandelette Tests pour Cry & EPSPS Plantes et graines Protocole

15 Détection de protéines transgéniques RR sur le soja 1.3. ELISA sur bandelettes Détection de soja RR dans des échantillons alimentaires et quantification (Ghazi, 2007)

16 1.4. Avantages des tests sérologiques Mesure directe de la protéine active Validée et reproductible Analyse quantitative Analyse qualitative Nombre élevé d’échantillons Facile à mettre au point et à transférer dans d’autres laboratoires Largement accepté par les agences internationales de contrôle

17 Spécifique du caractère et non de l’OGM et doit être validé pour chaque matrice (basée sur ADN et protéines) Limité pour les procédés de transformation ou produit final Non expression de protéine détectable dans le produit Quantification par les méthodes sérologiques Variabilité des niveaux d’expression de la protéine : – À l’intérieur de l’évènement (variété) – Entre évènements exprimant la même protéine (ex : Cry1Ab) Effets variés du procédé d’échantillonnage sur la conformation des protéines et la fixation des anticorps Quantification d’un échantillon inconnu difficile Réactions croisées des anticorps 1.5. Inconvénients des tests sérologiques

18 Réactivités de différents maïs Bt-Cry1A(b) par ELISA 1.5. Inconvénients des tests sérologiques (Suite)

19 2. Méthodes basées sur les AN

20 Différentes méthodes Amplification d’acides nucléiques (cible ou signal) Hybridations (Southern, Northern, micro- arrays...) Combinaison de plusieurs comme PCR puis micro-array Techniques nouvelles

21 Les échantillons sont broyés est déposé par la suite dans un micro tube pour l’extraction Culot d’ADN obtenu après extraction, précipitation et centrifugation. 2.1. Purification d’ADN

22 Principales étapes de l’extraction d’ADN 1. Lyse Cellulaire pour l’élimination des débris cellulaires Par un détergeant (SDS, CTAB, MATAB)) 2. Extraction Phénolique pour la précipitation des protéines ADN dissous dans la phase supérieure aqueuse Phénol 3. Précipitation alcoolique des acides nucléique 2.1. Purification d’AND (Suite) Dissoudre dans du Tampon Tris-EDTA et conserver à 4°C

23 Lyse des parois cellulaires – Azote liquide Dégradation des membranes cellulaires – Détergents, CTAB ou SDS : utilisés pour inhiber l’activité des enzymes, et dissocier les protéines de l’ADN. Inactivation des nucléases – EDTA : chélateur qui fixe les cations Mg 2+ et Protéinases, requis pour l’activité enzymatique des nucléase Séparation des polysaccharides Séparation des constituants cellulaires hydrophobiques -Lipides et polyphénols- avec un solvant organique Séparation de l’ADN du détergent avec de l’alcool 2.1. Purification d’ADN (Suite)

24 Pores larges Gel < à 0,9 % = fragments de très grande taille (ex: ADN génomique= gel à 0,6%) Gel à 0,9% = fragments de 0,5 à 7 Kb) Gel à 1,5% = fragments de 0,2 à 3 Kb Électrophorèse des ADN extraits en gel d’agarose 2.2. Visualisation de l’ADN

25 PH neutre. ADN chargé négativement. Migration vers le pôle + 2.2. Visualisation de l’ADN (Suite) Électrophorèse des ADN extraits en gel d’agarose

26 Révélation des l'ADN par le bromure d'éthidium Bromure d'éthidium (concentration finale : 0.5 µg/ml) (Extrêmement dangereux : Porter des gants) Visualisation des bandes révélées avec le BET avec un transilluminateur UV (Dangeureux pour les yeux : Porter des lunettes) 2.2. Visualisation de l’ADN (Suite) Électrophorèse des ADN extraits en gel d’agarose Liaison du bromure d'éthidium à l’ADN db en s’intercalant entre les bases

27 Le gel est mis dans une solution de BET qui se lie aux molécules D’ADN. Émission d’une fluorescence sous UV Photographie du gel avec un appareil polaroid ou numérique dans une chambre obscure. 2.2. Visualisation de l’ADN (Suite) Électrophorèse des ADN extraits en gel d’agarose TP 3 e Cours Régional. Cotonou, 2010)

28 2.3. Amplification enzymatique in vitro - PCR Méthode qui permet de créer de nombreuses copies d’un fragment d’ADN spécifique, en un temps réduit. Pour une amplification Pour une amplification : Extrait d’ADN (ADN cible) Nucléotides (dNTP): A, T, G, C Taq DNA polymerase Amorces, Tampon de réaction ADN polymérase : synthèse d’un brin d’ADN complémentaire à l’ADN cible dans le sens 5’-3’. Retrouvée dans la Bactérie Thermus aquaticus Extension optimale à une température de 72-80 0 C Durée de vie de 40 min à 95 0 C Vitesse d’extension de 2-4 kb / minute

29 2.3. L’amplification enzymatique in vitro (Suite) Le cycle d’amplification

30 2.3. L’amplification enzymatique in vitro (Suite)

31 Détection des OGM dans des échantillons de maïs (Louanchi et al., 2008) Détection de la séquence du promoteur de 123 pb dans différents échantillons de mais Présence dans : P1, P4, P5, P8, B1-B6, A1 et A2 Absence dans : P2, P3, P6, P7, P9, B7, B8, A3 Détection de la séquence du terminateur de 118 pb dans différents échantillons de mais Présence dans : P1, P4, P5, P8, B1-B6, A1 et A2 Absence dans : P2, P3, P6, P7, P9, B7, B8, A3 2.3. L’amplification enzymatique in vitro (Suite)

32 Film

33 Sonde hybridation Sonde hybridée cible 2.4. Hybridation moléculaire -Fondée sur la complémentarité des bases A-T (U), C-G entre une molécule d’acide cible et un acide nucléique sonde. -Trois types de duplex peuvent être formés : ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN par ordre croissant de stabilité.

34 Fabriquées par des bactéries --> protection par dégradation des ADN étrangers. Coupent l’ADN à des sites spécifiques. Les sites sont différents selon les enzymes de restriction. Coupure en des sites palindromiques Couper l’ADN : Enzymes de restriction 2.4. Hybridation moléculaire (Suite)

35 PstI MseI

36

37

38 Southern Blot : Cible AND/Sonde ADN Découper l’ADN en fragments avec les enzymes de restriction. Faire migrer les fragment sur gel d’Agarose Transférer sur une membrane Soumettre la membrane à la sonde Autoradiographie Sonde marquée P 32 2.4. Hybridation moléculaire (Suite)

39 Southern blot : illustrations - 8 kb - 6 kb - 5 kb 6 kb2 kb sonde EEEE A 8 kb sonde EEE B 5 kb2 kb sonde EEEE C AABBCCABAC … 2.4. Hybridation moléculaire (Suite)

40 Film

41 Northern Blot : Cible ARN/Sonde ADN Procédure –Extraction ARN –Electrophorèse –Transfert Hybridation, lavages, révélation Application –Analyse de l’expression d’un gène 2.4. Hybridation moléculaire (Suite)