COURS CELULES SOUCHES (D. Aberdam) 2010 Ma 2/3: cours 1: Définitions et généralités sur les CS Ve 5/3: cours 2: CS somatiques et plasticité Ma 8/3: cours.

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1 COURS CELULES SOUCHES (D. Aberdam) 2010 Ma 2/3: cours 1: Définitions et généralités sur les CS Ve 5/3: cours 2: CS somatiques et plasticité Ma 8/3: cours 3: CS hématopoëtiques (Dr. Rouleau) Ve 12/3: cours 4: CS embryonnaires Ma 16/3: Partiel 1 Ve 19/3: cours 5: CS adultes et physiopathologie Ma 23/3: cours 6: CS reprogrammées (iPS) + labo Ve 26/3: Cours 7: CS tumorales Partiel 2 Ma 30/3: Partiel 2 Examen: 28 mai

2 BP280 Collagène VII Cytokératines Plectine kératinocyte

3 Hémidesmosomes BP280 Collagène VII Cytokératines Plectine kératinocyte

4 Derme Epiderme EPIDERMOLYSIS BULLOSA (EB) Peau EB EBS (R) EBJ (R) EBD (D et R) BP280 Collagène VII Cytokeratines 5/14 Plectine Epidermolyse Bulleuse Simplex Epidermolyse Bulleuse Jonctionnelle Epidermolyse Bulleuse Dystrophique

5 Anticorps monoclonal GB3 Immunisation de souris par des antigènes Collecte du sérum (lymphocytes B) Fusion des lymphocytes B avec une lignée lymphoma: hybridome Sélection clonale d’un hybridome

6 Anticorps monoclonal GB3

7 EBS EBJ EBD BP280 Collagène VII Cytokeratines K5/K14 Plectine Intégrine  6  4

8 Epidermolyse bulleuse jonctionnelle(EBJ) * * * contrôle EBJ

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10 Cellules du patient ARNm Protéines Northern blot RT-PCR Banque d’ADNc Banque d’expression Western blot IP Anticorps ADN génomique Southern blot PCR Banque génomique ChIP

11 Molécule trimérique, sécrétée dans la MEC IP IF Protéine sécrétée

12 Colonne d’affinité GB3 Anticorps polyclonaux Criblage de banque d’expression Clonage et séquençage Sequençage de peptides Oligonucléotides dégénérés RT-PCR et clonage

13 Collagène XVII (BP180) BP280 Laminine-5 Collagène VII Cytokératines Plectine Intégrine  6  4 NH 2 Laminine-5 2 -   1q25-q31 18p11.3 1q32 kératinocyte

14 33 33 22 Contrôle Patient Immunofluorescence sur biopsies cutanées

15 Liaison génétique entre le gène LAMC2 et l’EBJ-H Difficultés: trois gènes. caractère récessif et léthal 3 familles consanguines Recherche de microsatellites CA/GT proches (ou dans le locus LAMC2) 3 marqueurs AFM + un microsatellite lié à LAMC2 (variabilité de 13 allèles # dans la population caucasienne) CACA….CACA

16 5’ 3’ ADNc gène C P Hétéroduplex Homoduplex C P

17 Stop G A T contrôle 5 ’ 3 ’ T C G A Arg G A C Mutant T C G A Exon 3 Famille consanguine. Patient homozygote 33 33 22 Northern blot N M N M N M

18 Allele-Specific Oligonucleotide (ASO) Example d’une famille non consanguine Mutation portée par la mère Mutation portée par le père

19 Formes non léthales d’EBJ Expression réduite de laminine-5 mutée Etat traumatique, sans soins efficaces

20 THERAPIE GENIQUE CUTANEE Ex vivo biopsie cutanée culture in vitro de kératinocytes feuillets épithéliaux greffe génotypage Diagnostic transduction rétrovirale

21 Thérapie génique des EB Phénotype/génotype: - diagnostic (immunohistologie, moléculaire) - recherche de mutation Transfert de gène: - primo culture - choix du vecteur (lentivirus, intégrases,…) - réversion phénotypique Transplantation: - modèles animaux - prise de greffe - évaluation de la réponse immunitaire - expression du transgène in vivo sur du long terme - évaluation des risques de mutation insertionnelle du transgène

22 PRODUCTION D ’UN VIRUS « CURATIF » Vecteur viral Laminine 5 Culture in vitro de kératinocytes EB Production de particules virales

23 Réversion phénotypique de kératinocytes EBJ Cha î ne ß 3 - mutations R42X / E210K EBJ -R WT EBJ -R

24 detached cells (%) min 102030 MC reverted min 100 80 60 40 20 0 1020 30 DC 100 80 60 40 20 0 EBJ reverted EBJ Vinculine EBJ-R

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26 Applications potentielles de la thérapie génique cutanée correction de défauts géniques catabolisme de toxines circulantes sécretion de médicaments diffusibles

27 Day 9 Day 32 Souris ob/ob Promoteur K5-leptin-LacZ 1 2 Greffe d’épiderme human exprimant la leptine 0 0,5 1 1,5 2 2,5 051015 days serum leptin (ng/ml) Leptin HK control Correction du phénotype d’obésité par transplantation d’une peau transgénique Larcher et al.(2001). FASEB J 15: 1529-38

28 rescue (15 min) rescue (2 months) rescue (8 months)normal eye Retinite pigmentaire (cécité chez l’enfant). Touche les photorécepteurs (RPE) et l’enzyme RPE65 Permet la conversion du signal lumineux en signal électrique.

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