Chapitre 4: Conservation des souches pures. L'objectif de la conservation d'une souche Dans le cadre de la durée de conservation souhaitée, maintenir.

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1 Chapitre 4: Conservation des souches pures

2 L'objectif de la conservation d'une souche Dans le cadre de la durée de conservation souhaitée, maintenir la souche à conserver viable, disponible et à l'identique. En microbiologie, où on travaille avec des organismes unicellulaires, conserver viable à l'identique, c'est conserver viable dans des conditions qui gardent le génome à l'identique. La conservation doit évidemment exclure les contaminations. Selon les cas, les durées de conservation souhaitées varient de quelques jours à plusieurs années et le choix d'une technique de conservation sera fortement influencé par ce paramètre de durée. On verra dans la suite qu'on ne met pas forcément en œuvre des techniques qui garantissent l'absence totale de toute modification du patrimoine génétique d'origine de la souche à conserver lors de la conservation. Il faudra alors vérifier qu'on a maintenu à l'identique un ensemble de caractères génétiques et/ou morphologiques et/ou physiologiques et/ou biochimiques qui caractérisent la souche pure à conserver et qui sont d'intérêt pour les utilisateurs de la souche (les caractères sont définis par l'utilisateur en fonction de la nature de son travail sur la souche à conserver).

3 Exemples de domaines servant à la conservation différents  Un exemple pour taxonomistes: La conservation des souches types dans un souchier de référence de niveau international pour taxonomistes : dans l'idéal il faut assurer une conservation à l'infini, parfaite de très longue durée des souches types (ou de référence).  Un exemple en génie biologique: La conservation d'une souche sélectionnée et/ou obtenue par génie génétique pour une production en génie fermentaire (par exemple une souche destinée à la production industrielle d'un antibiotique ou d'une molécule à très haute valeur ajoutée ). Il s'agit au minimum de conserver absolument les caractéristiques d'intérêt biotechnologique pour tous les inoculums qui devront être gérés pendant la période d'exploitation de la souche. Et c'est assez délicat pour de telles souches qui ont tendance à dériver vers la sous-production.

4 En effet, les cellules qui produisent le composé d'intérêt biotechnologique – composé qui n'a pour elles aucun intérêt si ce n'est de baisser leur rendement physiologique - sont en général moins prolifiques que les cellules qui ont perdu cette activité : la pression de sélection naturelle est favorable à la disparition des caractéristiques d'hyper-production mises au point. D'où l'intéret d'une conservation très au point ! et pour plusieurs années !  Un exemple médical: La conservation d'une souche isolée sur un patient et transmise pour études complémentaires (typages moléculaire précis, études de réactions particulières vis à vis d'antibiotiques...) et à conserver dans le cadre d'une enquête épidémiologique. Une conservation de courte durée sur quelques semaines ou quelques mois peut suffire.

5 L'idéal théorique de la conservation est le suivant: arrêter toutes les réactions chimiques dans la suspension de cellules à conserver (on serait ainsi sûr de préserver la totalité de ce vivant à l'identique) en maintenant la viabilité, la disponibilité pour une reprise de culture ultérieure.

6 Les différents procédés de conservation des souches

7 Conservation de souches microbiennes par congélation Le principe : Les basses températures vont permettront d'arrêter toutes les réactions chimiques cellulaires par la cristallisation de l’eau et donc de conserver de façon parfaite (du moins en théorie). Il suffira de réchauffer pour remettre en route. En pratique, dès -30°C, les cinétiques des réactions chimiques sont très lentes, les évolutions sont réelles mais se font sur de nombreux mois. A -80°C, il n'y a quasiment plus aucune évolution chimique. A -196°C, plus rien ne bouge.

8 Malheureusement, on va se trouver confronté à deux gros problèmes : l'eau cristallise aux basses température et les cristaux de glace peuvent endommager de façon léthale (mortelle) les cellules. Il va donc falloir gérer les basses température en évitant l'apparition des cristaux de glace léthaux. Et ce lors de la congélation mais aussi lors du réchauffage (le réchauffage est une étape cruciale qui peut être fatale) ; lors de la cristallisation de l'eau il apparaît une phase aqueuse résiduelle hyper-osmotique qui peut conduire à des effets osmotiques léthaux (notament par effet sur les protéines). Autre problème, conserver au froid est couteux en énergie et en surveillance.

9 Une méthode de conservation d'une souche par congélation doit donc proposer un mode opératoire pour le refroidissement: composition du milieu avec présence de tel ou tel cryoprotecteur (Les 2 cryoprotecteurs les plus utilisés en microbiologie sont le glycérol et le diméthlsulfoxyde ((CH 3 ) 2 SO) de la classe des cryoprotecteurs de petite taille pénétrant les cellules  des molécules polaires évidemment), dimension des conteneurs et cinétique de refroidissement pour atteindre la température de conservation fixée) et un mode opératoire pour le réchauffement (notamment la cinétique du réchauffement). Les modes opératoires seront plus ou moins simples selon les capacités des souches à résister aux effets dommageables.

10 Congeler des microorganismes et conserver à -20°C, -80°C, -196°C ? Les microorganismes bactéries ou levures ou moisissures se congèlent généralement selon des modes opératoires simples et donnant de bons taux de revivification après réchauffement (en tous cas de façon plus simple que les souches de cellules animales). A -20°C, les températures ne sont pas assez basses et le système évolue chimiquement et pas en bien... : on pourra conserver des bactéries, des levures, des moisissures quelques mois à quelques années cependant. A -80°C, les évolutions chimiques sont vraiment très très lentes. La plupart des microorganismes sont alors conservables avec une bonne viabilité si il y a eu congélation en présence de cryoprotecteurs comme le glycérol et le DMSO et si le réchauffement pour la revivification est rapide. Très intéressant donc pour les conservations sur plusieurs années. D'autant que les congélateurs -80°C sont désormais abordables. A -196°C, dans l'azote liquide, on est aussi parti pour des conservations possibles sur de très longues durées ! Dans tous les cas, attention aux ruptures de froid : coupures d'électricité, approvisionnement en azote liquide... C'est un gros problème en fait pour les conservations par congélation sur les longues durées !!

11 Conservation de souches microbiennes après dessiccation L'eau est le solvant des réactions chimiques du vivant. Après dessication, les réactions chimiques seront arrêtées (ou au moins ralenties) et la conservation est effective. Dessications simples Certaines bactéries supportent parfaitement la déshydratation en atmosphère naturelle sèche (on comprend un peu pourquoi en pensant à leur milieu naturel qui peut passer par des phases très sèches... nécessité). Celle-ci peut être facilitée par l'utulisation d'un vide partiel ou d'agents dessicateurs. Pour l'étape de déshydratation, les microorganismes sont répartis sur un support inerte comme du papier buvard ou du sable ou des grains de silice... Après la dessication, il faut assurer un stockage parfaitement sec, en général vers 0-4°C (conteneur étanche avec dessicateur dans une ambiance réfrigérée). La revivification s'effectue par immersion dans du milieu de culture. Conclusion : simple et pratique pour les souches qui supportent. Par exemple, les Entérobactéries sont dessicables sur papier buvard et peuvent se conserver ainsi, au sec, plusieurs mois.

12 Conservation de souches microbiennes après lyophilisation (cryodessication) La lyophilisation permet d'obtenir une déshydratation poussée compatible avec des durées de conservation très longues. La souche à conserver est : - congelée (avec tous les problèmes liés à la congélation à résoudre) - puis déshydratée par sublimation de la glace (évaporation de l'eau passant directement de l'état solide à l'état vapeur). Ceci exige de travailler à froid sous pression réduite ; - puis le lyophilisat est scellé et est stocké à l'obscurité, en général en atmosphère fraiche 0-4°C. La lyophilisation n'est pas compatible avec tous les microorganismes. Dans certains cas elle occasionne des altérations cellulaires et génétiques. La revivification (réhydratation) est réalisée par ajout de milieu de culture dans l'ampoule de lyophilisat. Lorsque les conditions pratiques pour une souche donnée sont au point, la lyophilisation est une excellente méthode de stockage sur le long terme et de gestion aisée (pas de problème de gestion d'azote liquide ou de congélateur à - 80°C... Exemples : des collections entières de souches dans les grands souchiers internationaux.

13 Les cultures bactériennes peuvent être conservées congelées ou lyophilisées dans diverses suspensions préparées à cet effet. Il existe de nombreuses formulations de suspension mais en général on utilise le lait écrémé, un milieu à base de sérum ou le milieu de polyvinylpyrrolidone (PVP) pour la lyophilisation. Pour la congélation, on utilise un bouillon de lait écrémé ou de sang ou encore un bouillon trypticase-soja avec 15 à 20 % de glycérol.

14 Formes naturelles à vie ralentie La nature "a prévu" la conservation : formes naturelles: spores Certaines souches de bactéries ou de champignons présentent naturellement des différenciations en formes de conservation : spores ou cystes. De telles cellules sont en inactivité métabolique naturelle. Il faut et il suffit d'assurer des conditions dépourvues de mutagènes physiques (rayons U.V....) qui maintiennent cette inactivité. Les souches Bacillus sporulent en endospores particulièrement thermorésistantes à la chaleur humide et stables. Et on connaît les nombreuses souches Bacillus utilisées dans l'industrie pour des productions d' exoenzymes de type protéase... Les souches Streptomyces (par exemple pour la production d'antibiotiques) sporulent en exospores qui, si elles ne résistent pas aux chaleurs humides élevées comme les endospores de Bacillus mais se conservent de nombreuses années au sec, à l'obscurité et au frais.

15 Conservation de souches microbiennes en milieux de conservation par repiquages successifs La souche se maintient sur un milieu de culture : les milieux de conservation. On fait végéter une souche sur un milieu de culture en la repiquant le moins souvent possible. Une méthode qui ne peut éviter les dérives génétiques et donc généralement à éviter...

16 Pour minimiser le développement des variants on doit : (i) utiliser des conditions environnementales de culture et une composition chimique des milieux de culture qui maintiennent les cellules dans un état métabolique réduit, qui occasionnent des temps de génération très longs. (ii) utiliser des milieux qui maintiennent une pression de sélection élevée sur les caractères qui caractérisent la souche à conserver. Ainsi les milieux de conservation sont toujours des milieux "pauvres" et/ou sélectifs de caractères. (iii) éviter tous les agents favorisant les mutations, en particuliers la lumière. Exemple pratique pour lequel on utilise une conservation sur milieu de conservation: les conservations de souches pour compléments d'études dans les laboratoires, pour des durées de quelques semaines / Échanges de souches entre laboratoires

17 La gélose au sang (BAB), la gélose Trypticase-soja (TSA) et la gélose d’infusion de coeur (HIA) sont des bons milieux de conservation des organismes entériques. Il ne faut jamais conserver les souches dans un milieu contenant des hydrates de carbone car les produits acides du métabolisme diminuent rapidement la viabilité. BAB, TSA ou HIA contiennent du NaCl, qui améliore la pousse de V. cholerae. Ne pas employer de gélose nutritive car elle n’a pas de sel ajouté. Fermer hermétiquement les tubes avec des bouchons de liège trempés dans de la paraffine chaude ou avec des bouchons à vis bien serrés. Conserver à l’obscurité à une température comprise entre 22 à 25°C. De l’huile minérale stérile peut aussi être utilisée pour prévenir le dessèchement des géloses en pente.

18 Souches de conservation délicate Il s'agit de souches particulières : pour Streptococcus pyogenes, S.agalactiae, S.pneumoniae : Nous les conservons assez bien sur gélose chocolat supplémentée en tubes (en vérifiant l'humidité) et congelées. pour Haemophilus et Neisseria : Seule solution : le congélateur.

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