EXAMEN BACTÉRIOLOGIQUE DU SPERME Spermoculture et Spermogramme.

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1 EXAMEN BACTÉRIOLOGIQUE DU SPERME Spermoculture et Spermogramme

2 I. Introduction L’exploration des infertilités d’origine masculine bénéficie, depuis quelques années d’un contrôle plus rigoureux des paramètres spermatiques. Mais il n’est pas faux de dire que l’analyse bactériologique du sperme fait partie également du bilan minimal d’un couple infertile en vue d’une assistance médicale de procréation.

3 Sperme?? C’est un mélange de sécrétions de diverses origines: testicules, vésicules séminales et prostatiques, glandes urétrales. À l’émission, il parcourt les voies spermatiques( épididyme, déférent) puis les voies urinaires au niveau de l’urètre où il peux se charger de bactéries urovésicales.

4 II. Recueil du sperme Au laboratoire, après un délai d’abstinence de deux à cinq jours. Immédiatement après vidange vésicale totale (permet l’élimination des contaminants ou des germes éventuellement responsables d’urétrite. Lavage soigneux des mains au savon. Lavage du gland avec la lingette désinfectante remise par le laboratoire. Puis l’éjaculat total est recueilli par masturbation dans un réceptacle en plastique stérile non toxique, gradué. Le sperme, normalement épais et visqueux, est mis à liquéfier 30 à 60 mn à 37 °C, puis traité après homogénéisation.

5 III. Quelle place pour le spermogramme? Il permet d’évaluer certains caractéristiques du sperme: Macroscopiques: volume, pH, viscosité, couleur, et liquéfaction. Microscopiques: concentration des spermatozoïdes, mobilité, vitalité, présence ou non d’agglutinats, concentration des cellules rondes et des leucocytes

6 Signes d’appels pouvant faire évoquer une béctériospermie positive Allongement du temps de liquéfaction Asthénospermie et/ou teratospermie. Agglutinats Présence de cellules rondes Leucospermie L’interprétation des variations de ces caractéristiques permet de décrire une situations assez caractéristiques

7 III. Quelle place pour le spermogramme? La suspicion d’une infection du sperme peux se manifester par l’association: - Asthénospermie ( altération de la mobilité fléchante) - Nécrospermie - Leucospermie -Teratospermie ( spermatozoides à flagelle enroulé >10%) Insuffisance prostatique: - pH et viscosité augmentés - Asthénospermie ou sans hypospermie Insuffisance des vésicules séminales (lithiase, inflammation): - pH acide - Hypospermie - Asthénospermie sévère - Nécrospermie

8 IV. Quelle place pour la spermoculture? Vise à expliquer une altération des paramètres spermatiques consécutives à la présence de bactéries dans le sperme: spermoculture médicale. Et à rechercher tous les germes qui pourraient contaminer le milieux de culture lors de la réalisation d’une fécondation in vitro: spermoculture analytique.

9 V. Techniques de la spermoculture La spermoculture doit obéir à des règles rigoureuses de recueil, d’exécution et d’interprétation. Diagnostic d’inflammation : examen cytologique qualitatif et quantitatif discriminant entre les cellules de la lignée germinale, les polynucléaires et les macrophages. Diagnostic d’infection : identification, numération et résistance aux antibiotiques des bactéries présentes. La distinction entre réelle infection ou contamination du prélèvement est délicate et pose le problème du traitement du patient ou de l’innocuité du sperme à préparer en cas d’AMP ( assistance médicale à la procréation). La présence d’ADN plasmidique de C. trachomatis après amplification génique signe sans conteste une infection.

10 V.1. Examens directs État frais : une goutte de sperme entre lame et lamelle montrera les spermatozoïdes, leur mobilité, les cellules rondes, les Trichomonas, les germes et les levures. Coloration de Gram : pour les germes et levures. Coloration de May Grunwald Giemsa: pour les cellules rondes (spermatocytes, spermatides, leucocytes, macrophages) et les Trichomonas.

11 V.2. Comptage des leucocytes Il peut se faire en hématimètre sur une dilution du sperme au 1/10 dans du tampon PBS à 12 % de bleu de méthylène. Les résultats sont peu reproductibles et utilisateur-dépendants. En cas de cellularité élevée on peut employer un réactif du commerce à la benzidine et cyanosine utilisant la réaction peroxydasique. Le leucoscreen est le plus utilisé mais les résultats sont sous- évalués en cas de leucocytes dégranulés. Les cytomètres en flux commencent à être utilisés et ont l’avantage de donner la formule leucocytaire.

12 V.3. Mises en culture On utilise des milieux sélectifs et hyperenrichis pour germes aérobies, anaérobies, levures, corynébactéries, mycoplasmes. La culture cellulaire pour les chlamydiae n’est plus utilisée. Il faut diluer pour éliminer le pouvoir bactériostatique du plasma séminal, et quantitativement pour énumérer les germes

13 V.3.1. Cultures aérobies et microaérophiles Le sperme dilué au 1/10 dans du bouillon de Schaedler pour aéroanaérobies est vortexé et ensemencé à raison de 100 μl par boîte de Pétri sur géloses au sang cuit («chocolat») supplémentée en vitamines et en antibiotiques, Columbia au sang de mouton additionnée d’acide nalidixique, et Drigalski ou au pourpre de bromocrésol. Les boîtes sont placées à 37 °C, sous atmosphère de 5 % de CO2 pour les géloses au sang, pendant 48 heures. Elles sont alors examinées, énumérées, et traitées pour l’identification bactérienne (galeries Api et tests spécifiques) et les antibiogrammes. Les boîtes de gélose chocolat sont replacées à 37 °C sous CO2 pour une éventuelle culture tardive du gonocoque.

14 V.3.2. Cultures anaérobies La même dilution au 1/10 est ensemencée sans attendre sur une boîte de gélose au sang de Schaedler pour anaérobies sans inhibiteurs, et incubée en jarre anaérobie en milieu CO2 + H2 pendant 48 heures. Les premières cultures sont examinées, comptées et traitées, puis les boîtes sont replacées en anaérobiose et réexaminées au bout de cinq jours. Les identifications sont effectuées sur galeries Api-ana et les antibiogrammes en gélose Schaedler en anaérobiose avec le choix approprié d’antibiotiques.

15 V.3.3. Cultures pour mycoplasmes Deux gouttes de sperme non dilué homogénéisé sont incorporées à un flacon de milieu A3 puis inoculées après vortexage à une galerie urée–arginine permettant la culture différentielle des Mycoplasma et des Ureaplasma ainsi que leur numération en UCC/ml. Cette technique est plus sensible dans le cas du sperme que la culture en gélose A7 et souffre peu de contaminations par la flore banale ; de plus, une culture tardive, en l’absence de contaminations, permet de mettre en évidence des quantités minimes de bactéries (entre 10 et 100 UCC/ml).

16 V.3.4. Cultures pour chlamydiae La culture cellulaire sur cellules HeLa 229 n’est plus pratiquée que lorsque la conservation de la souche microbienne est recherchée. La sensibilité de la culture cellulaire dans le sperme est basse (< 50 %). On peut l’accroître en ajoutant une immunofluorence directe (IFD) à partir du culot lavé utilisé pour la culture cellulaire qui, de surcroît, élimine la fluorescence non spécifique sur les agrégats de cristaux prostatiques. On ne peut observer que des corps élémentaires par cette technique (au moins trois par champ × 400 sont nécessaires).

17 V.4. Détection des acides nucléiques chlamydiens C’est actuellement la méthode de référence. Elle se fait par hybridation moléculaire après amplification de l’ADN plasmidique par réaction en chaîne à la polymérase (PCR) ou de l’ARN ribosomal (TMA ou (transcripted mediated amplification ).

18 V.5. Techniques immunologiques : les IgA sécrétoires séminales (IgAs) anti-C. trachomatis La présence d’IgAs anti-Chlamydia dans le sperme signe la présence à un endroit quelconque du passage du sperme, de tout ou partie de la bactérie capable d’antigénicité.

19 VI. Résultats de la spermoculture VI.1. Germes incriminés Boitrelle et al., 2012

20 VI.2. Le syndrome inflammatoire Il est caractérisé : - par la présence de leucocytes dans le sperme - Seuil de positivité selon OMS: 10 6 /ml Il survient : - lors d’une infection aiguë - à distance, de façon chronique Il se manifeste : - par la production de Dérives Actifs de l’Oxygène - par des peroxydations lipidiques - par une fragmentation de l’ADN

21 VII. Conclusion La recherche de l’infection et de l’inflammation est un pilier du bilan d’infertilité ou andrologique. Elle doit comprendre, outre la recherche de l’infection superficielle, la spermoculture, qui doit être menée avec des techniques modernes et interprétée avec des critères rigoureux dans le but de soigner une infection en cours, éviter la contamination de la partenaire ou des milieux d’AMP.

22 Glossaires - Asthénospermie: diminution de la vitalité et de la mobilité des spz - Teratospermie: présence de moins de 4% de spz de forme typique dans le sperme ( male formation de spz). - Nécrospermie: présence d’un très grand nombre de spz mortes. - Leucospermie: présence anormale de polynucléaires ( globules blancs). - UCC: unité de changement de couleur.