L’Étude des Microorganismes

Présentation au sujet: "L’Étude des Microorganismes"— Transcription de la présentation:

1 L’Étude des Microorganismes
Microbiologie L’Étude des Microorganismes

2 Définition d’un Microorganisme
Dérivé du grec: Mikros, «petit» et Organismos, «organisme» Organisme microscopique qui comprend soit une seule cellule (unicellulaires) ou amas de cellules identiques (non différentiées) Ils comprennent les bactéries, les champignons, les algues, les virus, et les protozoaires

3 Microorganismes en Laboratoire
Les Milieux de Croissance

4 Buts Croissance sous des conditions contrôlées Maintien
Isolation de cultures pures Tests métaboliques

5 Types Liquides (bouillons) Milieux Solides
Permets la culture en suspension Distribution uniforme des éléments nutritifs, environnementaux et autres Permets la croissance de grands volumes Milieux Solides Mêmes que milieux liquides + agent de solidification L’agar : Polysaccharide dérivé d’une algue

6 La Croissance en Bouillon
Non-inoculé Limpide Turbide + sédiment Turbide Limpide + sédiment

7 Croissance sur Gélose Croissance sur surface solide Croissance isolée
Permets l’isolation de colonies simples Permets l’isolation de cultures pures Colonie simple

8 Milieux Solides (suite)
Pente Croissance en surface et en profondeur Différentes disponibilités d’oxygène Entreposage à long terme Tube profond Milieu semi-solide Entreposage à long terme Faible disponibilité d’oxygène

9 Compter les Microorganismes

10 Méthodes Mesure de turbidité Comptes directs Comptes viables
Nombre le plus probable

11 Mesure de la Turbidité  Mesure la quantité de lumière qui peut traverser un échantillon Le moins de lumière qui traverse l’échantillon le plus dense est la population Mesure la densité optique ou le pourcentage de transmission

12 Mesure de la Turbidité Spectrophotomètre (A600):
Mesure de la Densité Optique (D.O.) Lumière 600nm Détecteur….lecture Lecture différente

13 Mesure de la Turbidité Relation inverse 2.0 1.0 D.O. 600nm
2.0 1.0 D.O. 600nm % Transmission 100 50 Densité cellulaire Relation inverse

14 Comptes Directes L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

15 Comptes Directes Avantages: Désavantages: Rapide
Aucune croissance requise Aucune information a propos de l’organisme est requise Désavantages: Ne discrimine pas entre vivant et mort Peux être difficile de discriminer entre les bactéries et les détritus

16 Utilisation d’un hémacytomètre

17 Utilisation d’un hémacytomètre (suite)

18 Hématimètre Cette lame possède 2 cellules de comptage indépendante

19 Utilisation d’un hémacytomètre (suite)

20 Déterminer le Compte Direct
Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants ayant les même dimensions 8, 8 et 5 Déterminer la moyenne ( )/3 =7 Donc 7 cellules/carré

21 Déterminer le Compte Direct (suite)
1mm Profondeur: 0.1mm 1mm Calculer le volume d’un carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

22 Problème Un échantillon est appliqué à une lame d’hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon original si la chambre de comptage possède 100 carrés?

23 Comptes Viables Cellule viable: une cellule capable de se diviser et de générer une population (ou colonie) Un compte viable est fait en diluant l’échantillon original Étaler des échantillons des dilutions sur un milieu de culture approprié Incuber sous les conditions appropriées pour permettre la croissance Des colonies sont formées Les colonies sont comptées et le nombre original de cellules viables est déterminé en fonction de la dilution

24 Comptes Viables Dilutions en séries de l’échantillon
Étalement des dilutions sur milieu approprié Chaque colonie simple est originaire d’une unité formatrice de colonie (UFC) Le nombre de colonies est équivalent à une approximation du nombre de bactéries vivantes dans l’échantillon

25 Dilution d’un Échantillon de Bactéries

26 Dilution d’un Échantillon de Bactéries

27 Dilution d’un Échantillon de Bactéries

28 Dilution d’un Échantillon de Bactéries

29 Dilution d’un Échantillon de Bactéries
5672 57 4

30 Comptes Viables  Le nombre total de cellules viables est indiqué en tant qu’Unité Formatrice de Colonies (UFC) plutôt que nombre de cellule Chaque colonie est originaire d’une unité formatrice de colonie (UFC) Une plaque avec colonies est choisie Calcul: Nombre de colonies sur la plaque X la réciproque de la dilution (facteur de dilution)= Nombre d’UFC/mL Ex. 57 UFC X 106 = 5.7 X 107 UFC/mL

31 Dilution en série 63 UFC/0.1 ml de UFC/1.0 ml de UFC/ml X 105 = 6.3 x 107/ml dans l’échantillon original S’il y avait 100 ml d’échantillon bactérien?

32 = = Comptes Viables Avantages: Limites:
Dénombre les microorganismes viables Peu distinguer différents microorganismes Limites: Pas de milieu universel Ne peut pas demander combien de bactérie dans un lac Peut demander combien d’E. coli dans un lac Nécessite la croissance du microorganisme Seule les cellules vivantes génèrent des colonies Des amas ou des chaînes de cellules génèrent une seule colonie UFC une bactérie Ex. Un UFC de Streptococcus  un de E.coli = ? = ?

33 Nombre le Plus probable: NPP
Fondé sur les statistiques de probabilités Test présomptif fondé sur des caractéristiques données Technique en bouillon

34 Nombre le Plus Probable (NPP)
Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque dilution dans chaque tube Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

35 NPP (Suite) L’objectif est de DILUÉ l’organisme à zero
Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontre les caractéristiques désirées sont enregistré Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre Dilutions: Tubes positifs: Choisir la bonne suite: 321 et la retrouver dans le tableau Multiplier le résultat par le facteur de dilution central 150 X 102 = 1.5 X 104/mL Puisque vous avez 1g dans 10mL doit multiplier encore par 10 1.5 X 105/g

36 La Microscopie Les Colorations

37 Colorations Simples Coloration positive Colorations négatives
Coloration du spécimen Coloration indépendante de l’espèce Colorations négatives Coloration de l’environnement de fond

38 Méthode Coloration simple: Un seul agent de coloration
Permet de déterminer la taille, la forme, et l’arrangement des cellules

39 Les Formes Cellulaires
Coccus: Sphères Division sur 1,2 ou 3 plans Nombre de plans de division donne différents arrangements Arrangements typiques de différents genres bactériens

40 Les Cocci (Coccus) Plans de division Arrangements Diplococcus
Streptococcus (4-20) Tétrade Staphylococcus Indice: si le nom du genre de bactéria finisse par coccus, la forme de la bactérie est cocci

41 Les Formes Cellulaires (suite)
Bacilles: Bâtonnets Division sur 1 plan seulement Arrangements typiques de différents genres bactériens

42 Les Bacilles Plans de division Arrangements Diplobacille
Streptobacille Eg. Clostridium = bacille Indice: si le nom du genre de bactérie finisse par bacille, la forme de la bactérie est bacille Si elle ne finisse pas par cocci, c’est probablement une bacille.

43 Colorations Différentielles
Microscopie Colorations Différentielles

44 Coloration de Gram (coloration différentielle)
Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives

45 Gram Positives Colorées Mauves Bacille Coccus
Genres: Bacillus et Clostridium Coccus Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

46 Gram Négatives Colorées Rouges Bacille: Coccus:
Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. Coccus: Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter

47 Règles Si le nom est bacillus et/ou clostridium
= Gram (+), bacille Si le nom finisse par coccus ou cocci (autre que les 3 exceptions, qui eux sont Gram (-)) = forme de coccus et Gram (+) Si ça fait pas partie des règles ci-dessus, = Gram (-) bacilles

48 Coloration de Gram - Principe
Utilise une combinaison de deux colorants Coloration primaire - Cristal violet Mauve Coloration secondaire – Safranine Rouge Gram positif La paroi permet de piéger le 1er colorant Gram négatif La paroi ne permet pas de piéger le 1er colorant

49 Paroi Cellulaire

50 Méthode - Coloration Primaire
+ Coloration avec le cristal violet Ajout d’iode de Gram (Mordant) + + Paroi: peptidoglycane LPS Membrane plasmique Gram positif Gram négatif

51 Méthode - Étape Différentielle
Lavage à alcool Paroi est déshydratée et moins perméable – Complexe colorant + iode est piégé Couche LPS est dissoute Paroi est déshydratée, mais perméable – Complexe n’est pas piégé Paroi: peptidoglycane LPS Membrane plasmique + + Gram positif Gram Négatif

52 Méthode - Contre Coloration
+ Coloration avec la Safranine + + Paroi: peptidoglycane LPS Membrane plasmique + Gram positif Gram Négatif

53 Sommaire Fixation Coloration primaire Violet de cristal Lavage
Décoloration Contre coloration Safranine

54 Coloration Acido-Alcoolo-Résistante
Coloration diagnostique de Mycobactérium Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre Paroi cellulaire avec acide mycoïque Cireuse, très imperméable

55 Méthode Principe: Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants

56 Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur
Coloration avec de la fuchsine basique À base de phénol, soluble dans la couche mycoique Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de l’alcool acide Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant

57 Coloration de Spores Spores: Cellule bactérienne différentiée
Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques Alors, très résistante aux colorant aussi! Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à l’endospore E.g. Anthrax

58 Coloration au Vert de Malachite
Spores (structures résistantes utilisées pour la survie dans des conditions défavorables) Sporangium (strucutre dans laquelle les spores se forment) Endospore (dormant, non reproductrices) Cellules végétatives (en croissance active) Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine