Culture de cellules et de tissus

Présentation au sujet: "Culture de cellules et de tissus"— Transcription de la présentation:

1 Culture de cellules et de tissus
Page Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

2 Culture de cellules et de tissus
Page Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

3 Culture de cellules et de tissus
Page XXe siècle : culture de tissus Perfectionnement de la technique 1950: Culture de cellules Trypsinisation (trypsine)

4 Culture de cellules et de tissus
Page 42 Culture de tissus ? Le terme général englobant le prélèvement de cellules, tissus ou organes d’un animal ou d’une plante et leur placement ultérieur dans un environnement artificiel (in vitro) conduisant à leur croissance (mitoses)

5 Culture cellulaire Définition:
Page 42 Définition: Le maintien en dehors de l’organisme (in vitro), des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser et d’exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques.

6 Techniques d’obtention
Culture cellulaire Pages 2 types de cellules: Libres et circulantes (¢ sanguines) Prélèvement et centrifugation En cohésion entre elles (tissu) Explants ou digestion enzymatique Techniques d’obtention Avantages et inconvénients

7 Culture cellulaire Les méthodes de culture:
Page 43 Les méthodes de culture: Culture stationnaire ou monocouche Affinité des ¢ au support (plastique ou verre) ↑ Rendement Culture en suspension

8 Culture cellulaire Contrôler la fonctionnalité: La prolifération ¢
Page 43 Contrôler la fonctionnalité: La prolifération ¢ Préservation des fonctions spécialisées

9 Culture cellulaire Evolution in vitro: La prolifération ¢
Page 43 Evolution in vitro: La prolifération ¢ Préservation des fonctions spécialisées Ok mais elle peut ralentir Modification et disparition (dédifférenciation)

10 Culture de cellules et de tissus
Page Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

11 Culture de tissus végétaux
Page 43 In vitro Cultures d’explants de plantes - milieu synthétique - conditions stériles - environnement contrôlé - espace réduit = matériel végétal de base qui servira à produire un clone - morceau de feuille - morceau de tige - un bourgeon - … ¢ végétales

12 Culture de tissus végétaux
Page 44 In vitro ? Cultures d’explants de plantes ? = matériel végétal de base qui servira à produire un clone - morceau de feuille - morceau de tige - un bourgeon - … ¢ végétales

13 Culture de tissus végétaux
Page 44 Les cellules végétales - Totipotentes ¢ végétales différenciées → indifférenciées → se divisent activement → se différencient → ¢ différentes Toutes les ¢ végétales sont capables d’exprimer toutes les informations génétiques contenues dans l’ADN. ≠ ¢ animales

14 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 1: Prélèvement de cellules isolées ou de tissus dans une feuille ou un autre organe.

15 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 2: Le prélèvement est déposé sur un substrat nutritif → maintien en vie = tissu biologique c ¢ indifférenciées → zone de croissance

16 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 3: Stérilisation de la surface du tissu prélevé Etape 4: Fragments de tissu déposés sur un milieu nutritif solidifié avec de l’agar-agar

17 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Si le tissu est dépourvu de chloroplastes (= hétérotrophe) Le milieu doit contenir - Sels minéraux - Sucre (saccharose ou glucose)

18 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Hormones végétales = phytohormones - Auxines - Cytokinines Mitoses

19 Culture de tissus végétaux
Pages Technique = masse cellulaire c amas de ¢ indifférenciées

20 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 5: Le cal est mis en suspension (milieu liquide) → dissociation des ¢ calleuses

21 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 6: Filtration à travers une gaze→ ¢ calleuses

22 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 7: ¢ calleuses → culture

23 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 8: ¢ calleuses → culture → masse cellulaire

24 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 9: ¢ calleuses → culture → masse cellulaire → cal

25 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 10: Clonage des ¢ calleuses → ↑ rendement Le clonage est d’abord une stratégie de reproduction naturelle (fraisier; pomme de terre; jonquilles…)

26 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 11: Variation et combinaison [phytohormones] → formation organes.

27 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 12: Formation de tiges

28 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 13: Les plantules présentent des radicelles (petites racines) et des petites feuilles.

29 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 14: Transplantation des plantules dans des pots

30 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 15: Développement → plante mature

31 Culture de tissus végétaux
Cellule végétale: = protection → barrière aux échanges d’information génétique

32 Culture de tissus végétaux
Page 45 Tissu végétal: Comment peut-on séparer les cellules d’un tissu végétal ? Enzymes : pectinases et cellulases (champignons) → protoplastes = ¢ sphériques sans paroi

33 Culture de tissus végétaux
Page 45 Protoplastes: Agents stabilisants Utilisation expérimentale comme les ¢ animales Transfert direct de gènes (PEG; électroporation; microinjection)

34 Culture de tissus végétaux
Page 45 Protoplastes: Conditions favorables 1.- Reconstitution de la paroi pectocellulosique 2.- Réarrangement des organites 3.- Divisions cellulaires → microcolonies → cals

35 Culture de tissus végétaux
Page 45 Pas chez toutes les espèces végétales Cals Plantules Milieu de régénération Embryons somatiques

36 Culture de tissus végétaux
Page 45 Protoplastes: Toutes les espèces végétales Régénération de plantules → toutes les espèces Monocotylédones (céréales) Dicotylédones

37 Culture de tissus végétaux
Page 45 Cotylédon(s) = feuille(s) primordiale(s) constitutive(s) de la graine.

38 Culture de tissus végétaux
Page 45 Protoplastes: Toutes les espèces végétales Régénération de plantules → toutes les espèces Monocotylédones (céréales) Dicotylédones NON OK

39 Culture de tissus végétaux
Pages Utilisations des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique

40 Culture de tissus végétaux
Pages Utilisations des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique

41 Culture de tissus végétaux
Pages 46-47 L’hybridation somatique: = fusion des protoplastes (noyaux et cytoplasmes) - où ? - avantage ? - but ? Milieu approprié Surmonter barrières de la reproduction sexuée → espèces différentes (genre) Créer de nouvelles combinaisons ↑ productivité

42 L’hybridation somatique
Page 47 Exemples de genres utilisés: Petunia Daucus Carotte Solanum Pomme de terre, tomate, aubergine… Croiser des espèces → combiner plusieurs qualités - résistances - fixation d’azote atmosphérique → ↑ productivité

43 L’hybridation somatique
Page 47 Première expérience (1978) But: Solanum Tomate x pomme de terre = pomate → stérile tomates cultivables à basse température

44 L’hybridation somatique
Page 47 Technique (tabac): Centrifugation Sélection des hybrides

45 L’hybridation somatique
Page 47 Autres expériences: Solanum tuverosum = Pomme de terre cultivée - Introduction de gènes de résistance - à certains virus - au mildiou - à la pourriture bactérienne X Solanum brevidens (A. Sud)

46 L’hybridation somatique
Page 47 Autres expériences: Stérilisation mâle chez le colza et résistance à l’atrazine (herbicide)

47 L’hybridation somatique
Page 47 Comment peut-on faire fusionner les protoplastes (anions) ? Agents chimiques: 1.- Ca2+ et pH élevé → neutralisation charge électrique 2.- PEG → agrégation des ¢ + déstabilisation m.p → fusion Electrofusion: Champs électriques intenses de courte durée → déstabilisation m.p. → fusion + + +

48 L’hybridation somatique
Page 47

49 L’hybridation somatique
Pages Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

50 L’hybridation somatique
Pages Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

51 Fusion noyaux et cytoplasmes
Page 47 Fusion noyaux: Recombinaison + ou – importante entre chromosomes parentaux → transfert de gènes nucléaires Si recombinaison + + + → stérilité (pomate) Si recombinaison + → quelques fragments (asymétrique)

52 Fusion noyaux et cytoplasmes
Page 47 Fusion noyaux: Recombinaison + ou – importante entre chromosomes parentaux → transfert de gènes nucléaires Si recombinaison + + + → stérilité (pomate) Si recombinaison + → quelques fragments (asymétrique) Comment favoriser le transfert partiel ? En déstabilisant par irradiation l’ADN du donneur avant la fusion.

53 Fusion noyaux et cytoplasmes
Page 47

54 L’hybridation somatique
Page 48 Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

55 ADN mitochondriale et chloroplastique
Fusion cytoplasmes Page 48 = les cybrides: Fusion des noyaux → 1 noyau après mitoses + cytoplasme recombiné Mitochondries Recombinaison Chloroplastes Recombinaison, 1 seul type ADN mitochondriale et chloroplastique Modifications des relations nucléo-cytoplasmiques

56 Fusion cytoplasmes Obtention provoquée des cybrides:
Page 48 Obtention provoquée des cybrides: Irradiations létales → ¢ du parent donneur → inactivation du noyau → transfert des mitochondries et des chloroplastes uniquement

57 Fusion cytoplasmes Obtention provoquée des cybrides:
Page 48 Obtention provoquée des cybrides: En plus, traitement à l’iodo-acétate → ¢ du parent receveur → inactivation des organites → transfert du noyau uniquement Cybrides c noyau (receveur) + organites (donneur)

58 Les hybrides retenus Page 48

59 Culture de tissus végétaux
Page 48 Applications des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique = transfert direct d’ADN dans les ¢

60 Culture de cellules et de tissus
Pages Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

61 Culture de cellules Culture primaire Culture secondaire
Page 49 Culture primaire ¢ proviennent directement d’un tissu ou d’un organe Culture secondaire ¢ proviennent de la culture primaire ( ↑densité)

62 Obtention de ¢ hybrides
Page 49 = ¢ à deux noyaux Etudier les interactions entre les constituants cellulaires provenant de cellules différentes ¢ animale x ¢ tumorale → perte de chromosome humain → observer perturbations → attribuer un gène à un chromosome

63 Culture de cellules Page 50 Fusion cellulaire → cellules hybrides (2 parents différents) 1975: création de ¢ capables de produire des anticorps monoclonaux = anticorps issus d’un seul clone de plasmocytes, reconnaissant qu’un seul type d’épitope sur un antigène donné, donc très spécifique.

64 Anticorps monoclonaux
Page 50

65 Anticorps monoclonaux
Page 50 Fusion cellulaire: ¢ de myélome x un lymphocyte B hybridome Un type de cellule cancéreuse possédant la machinerie pour fabriquer des anticorps

66 Anticorps monoclonaux
Page 50 Hybridome: → lignée cellulaire immortelle

67 Anticorps monoclonaux
Page 50

68 Sélection des hybridomes
Page 51 Après la fusion 3 sortes de ¢: Les ¢ de myélome non fusionnées ou fusionnées entre elles. Les plasmocytes non fusionnés ou fusionnés entre eux. Les hybridomes.

69 Sélection des hybridomes
Page 51 Sur un milieu de culture spécifique (HAT) (HAT = Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine) Les ¢ de myélome utilisées sont des ¢ qui, par sélection génétique, ont perdu la faculté de produire une enzyme impliquée dans la synthèse de nucléotides. Enzyme, la ¢ ne peut pas vivre dans ce milieu.

70 Sélection des hybridomes
Page 51 Donc Les ¢ de myélome non fusionnées ou fusionnées entre elles meurent. Les plasmocytes non fusionnés ou fusionnés entre eux meurent après qqs jours Les hybridomes survivent.

71 Sélection des anticorps monoclonaux
Page 51 1.- On isole au hasard qqs hybridomes → culture séparée

72 Sélection des anticorps monoclonaux
Page 51 2.- Les ¢ se divisent durant qqs jours → clone d’hybridomes → un type d’anticorps monoclonaux 3.- Les anticorps se trouvent dans le surnageant 4.- Vérifier compatibilité des anticorps avec l’antigène.

73 Anticorps monoclonaux
Pages Réaction immunitaire humaine Solution ?

74 Anticorps chimériques « humanisés »
Comment ? Anticorps de souris

75 Anticorps chimériques « humanisés »
Page 51 Modifications génétiques (1984) C de souris → C humaines V de souris Réponse immunitaire humaine

76 ↓ Réponse immunitaire humaine
Anticorps humanisés Page 51 Modifications génétiques (1990) Région hypervariables de la souris → contact étroit avec l’antigène ↓ Réponse immunitaire humaine ↓ affinité

77 Application des anticorps monoclonaux
Page 51 Outils de diagnostic Thérapeutiques

78 Application des anticorps monoclonaux
Page 51 Outils de diagnostic Thérapeutiques

79 Application des anticorps monoclonaux
Page 51 Outils de diagnostic Détecter la présence de virus (hépatite B, herpés, SIDA) Détecter la présence de bactéries Détecter la présence de ¢ tumorales

80 Application des anticorps monoclonaux
Page 51 Outils de diagnostic Thérapeutiques

81 Application des anticorps monoclonaux
Page 51 Thérapeutiques On conjugue les anticorps avec Isotope radioactif → irradiation ciblée des ¢ tumorales en épargnant les tissus sains. Toxine → pour cibler et détruire des ¢ cancéreuses Bloquer un agent infectieux (récepteur cellulaire)

82 Cultures de ¢ en médecine
Page 52 Pourquoi ? Tester l’effet des médicaments ou des biomatériaux Lentilles de contact Prothèses dentaires Remplacer les expérimentations animales

83 Cultures de ¢ en médecine
Page 52 Quelles cellules ? Hépatiques Détoxification

84 Cultures de ¢ en médecine
Page 52 Autre fonction ? Production simplifiée et accélérée de vaccin antiviraux Vaccin contre la grippe Utilisation d’embryons d’oeufs de poulet (9mois) 2007, culture de cellules Avantages: rapide (4 mois) et flexible

85 Vaccin contre la grippe
Page 52

86 Cultures de ¢ en médecine
Pages 52-53 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales But Avantages Méthode Inconvénients Protocole de greffe

87 Cultures de ¢ en médecine
Page 52 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales (patient) Buts: Traiter les grands brûlés Traiter certaines maladies cutanées

88 Cultures de ¢ en médecine
Page 52 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Avantages: Prélever des bouts de peau sur des cadavres → rejet

89 Cultures de ¢ en médecine
Page 52 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Méthode: 1984, chercheurs américains, culture + greffe sur le corps d’un individu brûlé des sections d’épiderme à partir d’un petit échantillon de ses propres Ȼ épidermiques.

90 Cultures de ¢ en médecine
Coupe de peau:

91 Cultures de ¢ en médecine
Page 52 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Inconvénients: Portions de peau = épiderme Fonctionnalité ↓ sensibilité ↓ flux nerveux Transpiration et pilosité ↓ élasticité et ↓ régulation thermique

92 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Inconvénients: Durée de reconstitution = 3 semaines avant la greffe Patient n’a pas de peau Infections Déshydratation

93 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Inconvénients: Durée de reconstitution = 3 semaines avant la greffe Patient n’a pas de peau Infections Déshydratation Comment prévenir ces risques ?

94 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Inconvénients: Durée de reconstitution = 3 semaines avant la greffe Patient n’a pas de peau Infections Déshydratation Comment prévenir ces risques ? Xénogreffe Allogreffe

95 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Inconvénients: Durée de reconstitution = 3 semaines avant la greffe Patient n’a pas de peau Infections Déshydratation Comment prévenir ces risques ? Xénogreffe Allogreffe

96 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Inconvénients: Durée de reconstitution = 3 semaines avant la greffe Patient n’a pas de peau Infections Déshydratation Comment prévenir ces risques ? Xénogreffe Pansement biologique → ↓ pertes liquidiennes Allogreffe

97 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Inconvénients: Durée de reconstitution = 3 semaines avant la greffe Patient n’a pas de peau Infections Déshydratation Comment prévenir ces risques ? Xénogreffe Pansement biologique → ↓ pertes liquidiennes Allogreffe Problème !!

98 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Remplacement des cellules endommagées Cultures de cellules épithéliales Protocole de greffe:

99 Protocole de greffe Page 53 Ȼ épidermiques Biopsie de 2cm2 2 semaines

100 Protocole de greffe Page 53 greffe Jusqu’à quand ? greffe greffe

101 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Un grand brûlé à 90% Recouvert totalement après 3 mois

102 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Inconvénients de la technique Manque de souplesse de la peau = cartonnée Pourquoi ? Le derme

103 Cultures de ¢ en médecine
Coupe de peau: Matrice de fibre de collagène Différentes Ȼ Vaisseaux

104 Cultures de ¢ en médecine
Coupe de peau: Couche graisseuse Injection de Ȼ graisseuses (ventre ou fesses) après cicatrisation complète

105 Cultures de ¢ en médecine
Page 53 Avantage de ces injections: Eviter que la peau colle Aux tissus sous-cutanés Aux muscles Problèmes de mobilité