Séquençage d’une région ciblée en relation avec le développement musculaire dans la race bovine Limousine. Colloque ATC 2017.

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1 Séquençage d’une région ciblée en relation avec le développement musculaire dans la race bovine Limousine. Colloque ATC 2017

2 Contexte de l’étude : UMR 1061 – projets et objectifs scientiques
Génétique et mécanismes de contrôle : (i) de la prolifération et la différenciation des cellules musculaires, et (ii) des caractéristiques du muscle et de la viande démarche de Biologie intégrative en utilisant les approches de génétique, épigénétique et de génomique fonctionnelle Exploiter des modèles animaux et valider les concepts dans modèles d’application. Formation, Croissance et Maturation du Muscle Analyses d’associations Génotype/Phénotype

3 Contexte de l’étude : UMR 1061 – projets et objectifs scientiques
Associations génotype/Phénotype Régulation par glycosylation Régulation par GDF8 et ses partenaires Régulation par miRNA Développement Maturation Différenciation Prolifération Précurseurs totipotents Myoblastes Myotubes Myofibres Viandes

4 Contexte : la filière bovine allaitante
Cheptel bovin Français : Filière laitière Filière allaitante 4,1 M de vaches 19 M de têtes Objectifs de la sélection dans la filière allaitante : amélioration des aptitudes bouchères (qualité et quantité de la viande) amélioration des aptitudes d'élevage (facilité de vêlage) Enjeu économique majeur

5 Contexte : l’amélioration génétique des caractères
La Sélection classique : Taureau candidat Descendance Phénotype : index IBOVAL Recueil des performances Phénotypage Coût élevé Intervalle de génération Limitation Progrès génétique

6 Contexte : l’amélioration génétique des caractères
La Sélection Génomique : Phénotypage Diminution Coût Intervalle de génération Augmentation Progrès génétique

7 Contexte : Approches génomique bovine allaitante
Re-séquençage du génome bovin Identification de mutations causales Qualité de la viande Développement musculaire (DM) Principales races allaitantes Charolaise + Blonde d’Aquitaine Limousine Etude du DM UGMA/IngénomiX

8 Contexte : La région d’intérêt
Etudes d’association : région de 4,439 Mb, située un Chr. Aut. : fortement associée au DM 19 gènes, 2 pseudogènes et 5 mi-ARN

9 Contexte : Stratégie Générale
98 individus sélectionnés (haplotypes, phénotypes) Capture de la région d’intérêt : SureSelect (Agilent Technologies) Séquençage sur la plate-forme haut débit Ion Proton (Life Technologies) Echantillons d’ADNg bovin Fragmentation Contrôle qualité Fragments d’ADN d’environ 130 pb Ajout des adaptateurs et barcodes Localisation génomique Fragments d’ADN avec adaptateurs et barcodes Purification Amplification Contrôle qualité Design des sondes ARN avec le logiciel SureDesign Librairie de capture SureSelect Fragments d’ADN amplifiés et purifiés Hybridation des librairies Hybridation Incubation pendant 24h à 65°C Capture de la région d’intérêt avec Sureselect Région d’intérêt capturée Amplification Purification Pool des échantillons Sélection de taille sur E-gel Librairie amplifiée Séquençage

10 Protocole : Le design des sondes
Capture grâce à sondes (2X) Presque 100 % des régions codantes couvertes Capture totale théorique : 68,5 % de la région d’intérêt

11 Protocole : préparation des librairies
Matériel de départ Préparation des librairies Capture de la région d’intérêt Amplification post-capture ADN génomique (1 µg extrait) Fragmentation Purification/Sélection de la taille des fragments Billes magnétiques Agencourt Méthode enzymatique ou sonication : Fragmentation aléatoire 130 pb Ajout des adaptateurs + Barcode Amplification PCR : 7 cycles d’amplification A PI + Barcode 220 pb 220 pb, 750 ng

12 Protocole : Capture de la région d’intérêt
Librairie amplifiée Tampon d’hybridation SureSelect Sondes ARN biotinylées Hybridation (16 à 24 H) Librairie hybridée Capture Librairie capturée Fraction éliminée Billes magnétiques + Streptavidine Enrichissement

13 Protocole : amplification post-capture
Matériel de départ Préparation des librairies Capture de la région d’intérêt Amplification post-capture Librairie capturée Amplification : 10 cycles (10 pM) Multiplexage Sélection de la taille des fragments (E-gel)

14 Protocole : amplification clônale
=> Au final toutes les Ion spheres templated (mono/polyclonales) sont collectées

15 Protocole : principe séquençage Ion Torrent

16 Résultats : exemple de run proton

17 Résultats quantitatifs
98 échantillons séquençés en 12 runs (multiplexage X8 et X10): ~9,5 M des reads/éch (~125pb) 99 % des « reads » mappées sur génome bovin mais : 24 % de duplicats de PCR 25 % des reads sur région cible ~57 % de la région-cible séquencée (20 X) 92% des régions codantes (20X) Au final, variations détectées (6465 SNPs et 607 Indels)

18 Résultats : exemple détection de variants
SNP position Échantillon 4 Hétérozygote A/G Position sur le génome Échantillon 6 Hétérozygote A/G Échantillon 9 Homozygote A/A Séquence de référence Alignement avec TMAP, visualisation avec IGV (Integrative Genomics Viewer)

19 Résultats : exemple annotation des variants
Alignement protéiques de 40 séquences orthologues du «gène X» (ClustalW) Mammifères Oiseaux et reptiles Poissons

20 Résultats : annotation globale des variants
47 % dans les régions intergéniques et 23 % dans les introns 35 mutations faux-sens et 4 impactant potentiellement codon stop 97,7% des SNPs et 94,6 % des indels dans dbSNP

21 Conclusions Validation stratégie et approche technologique (optimisation multiplexage, profondeur séquençage satisfaisante) Enrichissement très convenable : ~4640 SNPs et 307 indels détectés par échantillon Niveau d’analyse des séquences codantes optimum, plus contrasté sur séquences introniques et surtout intergéniques (intérêt ? Probléme des séquences répétées)

22 Confirmation détection et annotation des variants
Perspectives Confirmation détection et annotation des variants Analyses de concordance génotype/phénotype : sélection de(s) variant(s) d’intérêt => identification de mutation(s) causale(s) Génotypage sur l’ensemble de la population de référence => validation variant(s) d’intérêt/mutation(s) causale(s) Intégration dans plan de sélection chez la race limousine ( Amélioration rendement de production viande)

23 Remerciements Romain Philippe Sébastien Arico Nathalie Duprat
Gabrielle Delpy Véronique Blanquet Sébastien Arico Gaylord Auvray Marc Gambarotto Emilie Guérin Rémy Moulinas

24 Merci de votre attention