Transcription in vitro : principe et applications

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1 Transcription in vitro : principe et applications
MEB MANO Jordi – L3 Biologie Santé

2 D’après In vitro transcription and translation, Genetics Wiki.
Principe D’après In vitro transcription and translation, Genetics Wiki. Utilisation des principes de la transcription in vivo dans un système hors-cellule. ADN à transcrire sous forme de plasmide généralement. Promoteurs forts utilisés : Bactériophages T7, T3 ou SP6.

3 Matériel nécessaire Exemple du plasmide LITMUS (Evans et al., 1995)
ADN plasmidique : Séquence d’intérêt (ADNc) 2 promoteurs opposés (T7 ou autre) Un site de restriction unique dans chaque promoteur Pas de terminaison nécessaire D’après Principes de génie génétique ADN polymérase(s) spécifique(s) du promoteur Solutions de ribonucléosides triphosphates Autres : tampon (Mg2+,…), DNaseI, milieu sans RNase,…

4 Applications Traduction in vitro Protection à la RNase
Détermination de protéines se fixant à l’ARN Synthèse d’ARN antisens et siRNA Micro-injections Synthèse de sondes d’hybridation : Puces à ADN Blotting Hybridation in situ

5 Synthèse de sondes ARN Exemple du plasmide LITMUS (Evans et al., 1995)
Activité des promoteurs malgré la présence des sites de restriction Transcription dans le sens désiré : digestion par une des deux enzymes de restriction avant transcription D’après Principes de génie génétique Marquage de la « ribosonde » possible et facilité par la linéarisation du plasmide (haptènes, isotopes radioactifs,etc.)

6 Exemple d’utilisation de sondes ARN
Cas de l’hybridation in situ D’après Developmental Biology 9e Online Transcription de la ribosonde marquée à la digoxigénine (Dig) Hybridation avec l’ARNm cible Lavage-élimination hybrides non spécifiques 4) Ajout d’un anti-corps anti Dig couplé à une phosphatase alcaline 5) Lavage 6) Réaction enzymatique et coloration

7 Avantages/Inconvénients
Grandes quantités d’ARN synthétisées Rapide Marquage au cours de la synthèse Sondes très marquées: activité spécifique élevée Sondes sens et anti-sens Hybridation très stable (ARN/ADN ou ARN/ARN) Inconvénients Grande taille de la sonde : pénétration difficile dans le cas de l’hybridation in situ Hybridation à haute température Sensibilité aux RNases : préparation et stockage plus difficiles