Chapitre IV Exemple de quantification des molécules dans le cytosol, compartiments acides, mitochondries, noyau.

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1 Chapitre IV Exemple de quantification des molécules dans le cytosol, compartiments acides, mitochondries, noyau

2 Matrice extracellulaire
IV-1 cytosol, compartiments acides, mitochondries, noyau Cellule Modèle Matrice extracellulaire Mitochondrie Membrane plasmique Compartiments DY RE Centriole Cytosol Golgi Cytosquelette Noyau Lysosome Compartiments DpH Accumulation DpH Bases faibles DY Cations permanents Modèle utilisé pour suivre et quantifier le devenir de molécules exogènes qui pénètrent dans les cellules

3 IV.2 Relation entre les concentrations locales et globales
Les concentrations globales sont celles auxquelles on a accès lorsque l’on fait des mesures macroscopiques, par exemple la fluorescence d’une solution (telle qu’une suspension de vésicules ou de cellules en présence d’un fluorophore) dans une cuvette en quartz. Or ce qui est intéressant pour étudier les paramètres cinétiques de transport, les phénomènes de compartimentation , ce sont les concentrations locales intracellulaires. Il faut donc comprendre la notion de concentration locales et globales et savoir trouver les relations entre elles. La sonde peut avoir une cible intracellulaire pouvant provoquer une différence de concentration par rapport au cytosol: le noyau par exemple dans le cas des anthracyclines. De plus l’accumulation peut également être perturbée par un gradient de pH dans les compartiments acides (base faible) ou par un gradient de potentiel conséquent, au niveau de la membrane plasmique ou au niveau de la membrane mitochondriale généralement (molécule fluorescente chargée avec charge délocalisée) Dans ce qui suit on prend comme notation C : concentrations locales , V : volume local C : concentrations globales , V : volume global

4 C .V C.V Si on se place du point de vue local,
Conventions de notation : C : concentrations locales , V : volume local C : concentrations globales , V : volume global Si on se place du point de vue local, nombre de moles de sondes dans un compartiment: concentrations locales V le volume du compartiment considéré C .V Si on fait comme si les cellules et leurs compartiments n’existaient plus : le nombre de moles qu’il y avait dans le compartiment considéré devient: V le volume global, c’est à dire le volume total de la suspension cellulaire concentrations globales C.V exemple: Considérons une suspension cellulaire à 106 cell/ mL = 109 cell/L, on peut décider de se ramener à un volume total de suspension cellulaire V = 1 L  Pour un compartiment considéré, le nombre de mole est le même que l’on se place en concentration locale ou globale, relation entre les concentrations locale et globale C .V = C.V

5 Exemple de calcul de la distribution d’une molécule interagissant avec le noyau (la cellule est assimilée à un système à 3 compartiments ) Exercice 1 Soit une suspension cellulaire (10 6 cell/ mL) mise en présence d’une concentration totale CT= 1µM d’une molécule A fluorescente. - A est une base faible, ayant une affinité pour l’ADN, passant par diffusion passive la membrane plasmique (exemple: DNR) - On prend un volume moyen cellulaire tel que diamètre moyen = 12 µm - On considère que V noyau  V cellule (exemple: cellules cancéreuses) noyau cytosol pH i pH e Milieu extracellulaire C i C e C n On fait l’hypothèse que les cellules sont assimilables au modèle suivant : a)- Calculer le volume cellulaire d’un litre de la suspension à 10 6 cell/ mL et retrouver les relations entre les concentrations locales et globales de molécules A libres dans le milieu intracellulaire C i et Ci de molécules A liées dans le milieu intracellulaire C n et Cn de molécules A dans le milieu extracellulaire C e et Ce b) On se place dans les conditions où seule la diffusion passive intervient (exemple :cellules sensibles ou résistantes déplétées en ATP) pHi = pHe Montrer que CT  Ce + Cn

6 Correction exercice 1 a) calcul des volumes locaux :
Dans l’exercice 11 on s’intéresse aux concentrations extracellulaire indice « e » et intracellulaire (sonde libre dans le cytosol ou le noyau : indice « i » sonde liée dans le noyau : indice n ) . En assimilant la cellule à un système à trois compartiments (milieu extracellulaire, milieu cytosolique et noyau) Correction exercice 1 a) calcul des volumes locaux : Le volume de l’ensemble des 106 cell/mL ( 109 cell / L) est calculé comme suit : le volume d’une cellule : V une cellule= 4/3r3 D’où le volume de l’ensemble des cellules est V cell  10-3 L Vnoyau  Vcell = 10-3 L d’après l’énoncé Enfin , le volume extracellulaire est Ve = 1L-10-3L  1L car on considère un volume totale de suspension cellulaire de 1 L (on a 109 cell/L) On en déduit la relation entre les concentrations locale et globale intracellulaire C i × 10-3 = Ci (1) De même, la relation entre les concentrations locale et globale dans le noyau C n = Cn (2) et dans le milieu extracellulaire C e = Ce (3).

7 b) Si la concentration globale totale de sonde fluorescent est CT (= 1 µM) , on a CT = Cextracellulaire+Cintracellulaire avec C intracellulaire = C molécule libre + C molécule lié dans noyau CT = Ce + C i + Cn Avec Ce (extracellulaire), Ci (molécules libres) et Cn (molécules liées) Ou encore d’après (1), (2) et (3), CT = Ce + C i / Cn (4) Or on nous dit dans l’énoncé que l’on est dans des conditions telles que l’on n’a pas besoin de considérer de différence d’accumulation dues à un transporteur, un gradient pH ou un gradient de potentiel. Il n’y a donc pas de gradient de concentration entre le cytosol et le milieu extracellulaire , c’est à dire qu’en terme de concentration locales, on a : C e = C i Et d’après (3) : Ce = C i D’où la relation (4) devient : CT = Ce + Ce / Cn ou encore CT  Ce+ Cn

8 IV.3 Conséquences des concepts abordés dans l’exercice 1 :
 On peut faire un raisonnement analogue pour retrouver les relations entre concentrations locale et globale dans d’autres compartiments tels que les compartiments acides, ou les mitochondries, pour peu que l’on ait une estimation du volume de ces compartiments. (cf.exercices suivants)  Si l’on fait des mesures de fluorescence macroscopique avec une sonde quenchée par interaction avec le noyau (exemple anthracycline), ou une autre cible intracellulaire Il y aura une relation - entre la fluorescence quenchée et Cn - entre la fluorescence détectée et la concentration en drogue libre …. Ce ( et non Ce + Ci) Cela signifie qu’en terme de fluorescence, la sonde fluorescente libre dans la cellule contribue très peu à fluorescence détectée à l’échelle macroscopique. C’est ce que l’on utilisera dans l’exercice 12 par exemple

9 Exercice 2: sonde fluorescente (anthracycline daunorubicine) se distribuant dans des cellules cancéreuses et quantification à partir des données de fluorescence macroscopiques noyau cytosol pH i pH e Milieu extracellulaire C i C e C n A t=0, 106 cellules sensibles par mL sont mises en présence de 1 µM de DNR pHe=pHi On regarde en fonction du temps la variation de fluorescence par spectroscopie de fluorescence macroscopique a) Sachant que le signal de fluorescence est directement lié à la concentration en molécules libres (non quenchée) , déterminer à partir de la courbe, les concentrations globales Cn, Ce et locales C i dans ces cellules sensibles à l’état stationnaire. noyau cytosol pH i pH e Milieu extracellulaire C i C e C n b) Même question dans le cas de cellules résistantes (pour déterminer Ci R , on utilisera le fait que l’accumulation dans le noyau est liée à la constante d’affinité kaff et l’on considérera que kaff cellules sensibles = kaff cellules réssitantes Transporteur effluant la DNR

10 À la fluorescence macroscopique initiale Fo, correspond CT
À la fluorescence détectée à l’état stationnaire Fn correspond Ce (démontré dans l’exercice 10) À la fluorescence quenchée à l’état stationnaire Fo-Fn, correspond Cn Correction exercice 2 a) On en déduit par une simple « règle de trois » : Ce = Fn × CT / F0 De même, Cn = (Fo-Fn) × CT / F0 Mais au final, c’est la concentration locale intracellulaire qui a vraiment un intérêt…et ici on sait le déduire de la courbe facilement puisque que Ce = C i dans les cellules sensibles b) Dans les cellules résistantes , la surexpression d’un transporteur membranaire (P-gp ou MRP1) va provoquer à l’état stationnaire un gradient de concentration qui fera que CR i < C Re. Il y a donc une plus faible quantité de sonde liée au noyau et donc cela se traduit au niveau de la courbe par un quenching moins important. L’indice « R » est mis pour les cellules résistantes En pratique, pour déterminer les concentrations à partir de la courbe, on fera le même raisonnement que dans le a) , CRe = Fn × CT / F0 CRn = (Fo-Fn) × CT / F0

11 kaff × [ADN] = C n /C i avec kaff × [ADN] = constante .
par contre, pour la concentration locale intracellulaire de la sonde libre, C Ri on utilisera le raisonnement ci-dessous: Si il y a une interaction de la sonde fluorescente avec l’ADN (exemple anthracyclines) avec une constante d’affinité kaff, on a : kaff × [ADN] = C n /C i avec kaff × [ADN] = constante . Ant libre + ADN Ant lié D’après l’énoncé kaff (cellule résistante) = kaff (cellule sensible), le rapport des concentrations en molécule liée sur molécule libre ne change donc pas, que l’on soit dans des cellules sensibles ou résistantes. De même, après perméabilisation des cellules avec du triton X-100 (on note alors les concentrations de sondes libres et de sondes liées CN et CE) . Cela revient à considérer que D’où C Ri = C R n × C E / C N Comme l’on peut montrer que : CR n × 10-3 = CR n C N × 10-3 = CN et C E = C E C n / C i = C N / C E = CR n / C Ri avec CE = FN× CT / F0 CN = (F0-Fn.) × CT/F0 CRn = (Fo-Fn) × CT/F0 On en déduit : C Ri = CR n × C E / C N