Autoconservation des gamètes

Présentation au sujet: "Autoconservation des gamètes"— Transcription de la présentation:

1 Autoconservation des gamètes
Benoît Schubert Biologie de la Reproduction Pr Catherine Poirot Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière

2 AUTOCONSERVATION Gamètes matures Tissus gonadiques Spermatozoïdes
Ovocytes Tissus gonadiques Ovaire Testicule

3 Préserver la fertilité
chez l’homme

4 Historique 1776 - Spallanzani 1940 - Cryoprotecteur/ glycérol
Grossesse avec sperme congelé CECOS en France (G. David) et - Centres d’AMP intra conjugale

5 Techniques Milieux de congélation Mise en paillettes Extrémités soudés
Glycérol Agent cryoprotecteur pénétrant Toxique pour la cellule  Contact à basse température  Durée de contact limitée  Ajout en 4 étapes (moins délétère qu’en 1 fois) Mise en paillettes Extrémités soudés

6 Techniques Congélation Décongélation
cristallisation de l’eau extra-cellulaire Concentration relative des solutés augmente Déshydratation du spermatozoïde Décongélation Retrait du CP en plusieurs étapes Concentration relative des solutés diminue (milieu hypo-osmotique) Entrée d’eau dans le spermatozoïde Puis sortie du Glycérol Retour à un volume cellulaire normal

7 Techniques Congélation ‘lente’: en azote liquide Décongélation rapide
manuelle Vapeurs d’azote : 8-30 minutes Plonge dans azote liquide Appareils programmables Descente en température contrôlée 5°C/minute  - 10°C 10°C/minute  - 25°C 25°C/minute  - 150°C Décongélation rapide -196°C  37°C (en qq minutes)

8 Effets de la congélation sur les spermatozoïdes
Mobilité :  variable, environ 50% Vitalité :  variable, environ 50% Membrane : Gonflements Membrane plasmique Gonflement acrosome  perte acrosome Modification de la composition phospholipidique Noyau Chromosomes: pas de modification nb, structure, sex ratio Etat de sur-condensation de la chromatine

9 INDICATIONS PREVENTION AMP
TRAITEMENTS A RISQUES Chirurgie à risque Pathologies à risque Vasectomie Dégradation caract. spermatiques Situation à risque … Cryptozoospermie Spz chirurgicaux Spz médicaux Spz après chirurgie Spz contexte viral … L’autoconservation doit être « systématiquement proposée » avant une « thérapeutique ou intervention potentiellement stérilisante » Et peut être proposée « avant ou au cours d’une AMP » Arrêté du 12/1/1999

10 FEDERATION DES CECOS : 30 ans d’autoconservation
Avant Traitement (27182) Avant vasectomie (7904) AMP (9618) Spz chirurgicaux (2662)

11 FEDERATION DES CECOS : autoconservation maladie

12 Pourcentage d’hommes pour lequel la congélation a pu être réalisée
% Avant vasectomie 97% 91% 92% Avant traitement 65%

13 Patient Information autoconservation Accueil du patient personnalisé
Consultation avec médecin biologiste Méthodes Masturbation Recherche spermatozoïdes dans les urines Urgence du traitement : permanence de l’accueil Information des résultats de la congélation « Le patient doit être informé de la qualité du sperme et du nombre de paillettes » Arrêté du 12/1/1999

14 Techniques : rares spermatozoïdes
Mise en paillettes classiques ‘haute sécurité’ Micro-gouttes Guthauser et al., Andrologie 2002 SPZ  Intérêts : augmenter le nombre de « doses », faciliter la recherche des spermatozoïdes prêts à l’emploi

15 Sécurité Patient Générale Identité Traçabilité Consentement
Interrogation annuelle ‘Renouvelable sur demande écrite’ Utilisation Résultats Destruction « Seul le déposant peut demander la restitution ou la destruction » Sérologies HIV, VHB, VHC, Syphilis Paillette ‘haute sécurité’ Cuve de quarantaine Cuves spécifiques Accès locaux Sécurité azote

16 Problèmes Age Maladie de l’homme Indications autres
Limites supérieures Limites inférieures Puberté, possibilités de masturbation Maladie de l’homme Urgence Etat du patient Indications autres Vasectomies Professions Sportifs Information Patients et médecins

17 Perspectives Optimisation des méthodes de congélation Tissu gonadiques
Meilleure information sur l’autoconservation …. Lyophilisation du spermatozoïde !!! Wakayama T. Yanagimachi R., Nature Biotechnology 1998

18 Préserver la fertilité
chez le garçon prépubère

19 Introduction Enfant : préservation de la fertilité
A partir de ans : spermatozoïdes Avant ans Pas de spermatozoïdes éjaculés Cellules souches germinales mâles : spermatogonies Testicule Spermatogonies Pool de réserve : régénération  spermatozoïdes : à partir de la puberté Préserver la fertilité : spermatogonies

20 Stratégie de Préservation de la Fertilité des garçons prépubères
Avant le début du traitement stérilisant Prélèvement de spermatogonies Conservation spermatogonies : congélation Après guérison Greffe Culture Xénogreffe ? Recherche 20

21 Préserver la fertilité des garçons : Espoirs
Geens et al., 2008 21

22 Questions Quel volume de tissu à prélever ? Quel tissu conserver ?
Un testicule entier Fragments de testicule Quel tissu conserver ? Fragments de tissu Suspension cellulaire Quel protocole de congélation ? 22

23 Questions Contamination cellules malignes Contenu en spermatogonies
Tri cellules malignes/testiculaires  0,4% cellules malignes Seuil inconnu chez l’homme Contenu en spermatogonies Faible : 3/ cellules germinales (souris) Enrichissement ? Effets des traitements sur le testicule 23

24 Utilisation Tissu FRAIS : Allogreffe Résultats chez la souris
Injection spermatogonies dans tubules séminifères, rete testis, canaux efférents, … Production de spermatozoïdes Chez différentes espèces dont primates Résultats chez la souris Naissances Xénogreffe Tissu humain prépubère frais  souris nude (s/c) 4 et 9 mois après greffe : « qq spermatogonies survivantes » (Goossens et al., 2008) 24

25 Utilisation Tissu CONGELE Culture
Survie cellulaire (souris, lapin, humain, …) Xénogreffe sous cutané production de spz (souris) Survie spermatogonies (humain) Culture Souris Multiplication des spermatogonies obtention de spermatozoïdes Peu de résultats dans d’autres espèces 25

26 Autoconservations Spermatogonies
Radford et al., 1999 : 11 hommes Bahadur et al., 2000 : 2 garçons (8 et 13 ans) Keros et al., 2005 : 16 hommes Kvist et al., 2006 : 8 garçons (1 à 5 ans 1/2) Keros et al., 2007 : 5 garçons (2 à 14 ans) France : 3 centres (+ 20 patients) 26

27 En pratique Préservation de la fertilité chez jeune garçon
Conservation de cellules souches spermatogonies Utilisation A déterminer Dans 20 ans TTT potentiellement stérilisant, amélioration de la survie, la question de la qualité de la vie après le cancer est soulevée et la PF en est une part importante 27

28 En pratique Indications Technique expérimentale Multidisciplinarité
Consentements (parents) Technique expérimentale 28

29 Préserver la fertilité
chez la femme

30 Mise en péril du stock folliculaire
Stock de follicules : Pas de renouvellement 6.106 (intra-utérin)  (naissance)  0,5.106 (puberté)  …… 99% des follicules : atrésie Temps Chimiothérapie (Alkylants+++) / Radiothérapie Greffe médullaire : chimio+radio  ménopause 92% des cas (Meirow et al., 2001) Pathologies malignes : Femmes : K sein, K invasifs du col, leucémies, … Enfance : leucémie, neurob., LH, ostéosarc., sarc.d'Ewing, LNH Ovariectomie totale ou partielle : Endométriose, kystes bénins récurrents, tumeur Ménopause précoce prévisible : X (Turner, délétion, inversion), génétiques, …

31 Préserver la fertilité féminine aujourd'hui
Sans gamètes de la patiente : Don ovocytes Accueil d'embryons Adoption Avec gamètes de la patiente : Transposition ovarienne Traitement aux analogues du GnRH Congélation d'ovocytes : matures ou immatures FIV  embryons, congelés  transférés après guérison Cryoconservation du tissu ovarien  Combiner plusieurs solutions

32 CONGELATION D’OVOCYTES

33 Congélation d’ovocytes
Stimulation de l’ovulation : temps, traitement hormonal Pas de conjoint pas de désir d’enfants immédiat Ovocyte : cellule particulière, différente de l’embryon volumineux cytoplasme membrane plasmique protocole de congélation particulier Congélation lente Vitrification Effets de la congélation/décongélation: Dégranulation prématurée des granules corticaux  durcissement de la Z.P. Dépolymérisation du réseau de tubuline du fuseau méiotique et repolymérisation  aneuploidies, polyploidies ? Incubation de quelques heures pour permettre repolymérisation

34 Congélation d’ovocytes
Résultats Congélation lente 1ère grossesse : Chen et al., 1986 532 enfants nés ( ) Implantation/100ovocytes décongelés : 2,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 2,3-2,2 (Oktay et al., 2006;2008) Vitrification 392 enfants nés ( ) Implantation/100ovocytes décongelés : 6,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 4,5-5,8 (Oktay et al., 2006;2008) Technique prometteuse en évaluation Gook et Edgar, 2007

35 LA FECONDATION IN VITRO

36 La F.I.V. Stimulation de l’ovulation Conjoint
Temps Traitement hormonal Conjoint Désir d’enfants précipité ?

37 LA CRYOCONSERVATION DE TISSU OVARIEN

38 La cryoconservation du tissu ovarien
Pas de stimulation de l’ovulation Pas de conjoint Désir d’enfants différé Femme < 35 ans Enfant Prélèvement per coelioscopique : Selon le risque estimé de castration : 1 ovaire entier ou ½ ovaire Transport au laboratoire dans l’heure

39 La cryoconservation du tissu ovarien
Garde cortex ovarien uniquement: réserve folliculaire 1-2 mm épaisseur Médullaire ôtée Découpe en bandelettes (5 x 10 mm) Conservation : Milieu cryoprotecteur (PROH, sucrose, …) Cryotubes Descente en température contrôlée  -196°C

40 Utilisation du tissu ovarien congelé
Seuls les follicules primordiaux et primaires résistent à la congélation Maturation : GREFFE Autogreffe : Orthotopique, pelvienne : restauration de la fertilité naturelle Hétérotopique : sous cutané, intra-musculaire , … : FIV Xénogreffe : Souris immunodéprimées (nude, SCID, …) CULTURE IN VITRO COMBINAISON greffe/culture in vitro ?

41 Greffe de tissu ovarien congelé/décongelé
Autogreffe : Avantages "Simple" de réalisation Revascularisation ‘spontanée’ Succès chez animal et l’humain Inconvénients : Risque de transmission de cellules cancéreuses Destruction folliculaire Congélation/décongélation (survie 10 à 70%) Ischémie post greffe (+++)

42 Résultats 5 naissances rapportées à ce jour Donnez et al., 2004
Meirow et al., 2005 Demeestere et al., 2007 Andersen et al., 2008 Silber et al., 2008 September 24, 2004

43 Culture in vitro Avantages : Techniques : plusieurs étapes
Zone pellucide : exclue toute cellule, métastatique Techniques : plusieurs étapes Fragments de cortex ovarien : initiation de croissance ( follicule préantral) Isole le follicule du cortex ( follicule antral) Isole l'ovocyte ‘immature’ (follicule > 2 mm)  maturation finale

44 Culture in vitro Résultats :
Follicule primordial  ovocyte mature : Une espèce : Souris Eppig and O'Brien, 1996 : 1 souris vivante décès prématuré troubles neurologiques et hépatiques, obésité O’Brien et al., 2003 : 48 souriceaux vivants en bonne santé Femme : Follicule primordial  secondaire (2 semaines !) Follicule secondaire  antral Follicule antral  ovocyte mature fécondable Maturation in vitro : 1ère naissance : Veeck et al., 1983 Association xénogreffe puis culture in vitro ?

45 Histological sections of in vitro grown human follicles cultured first in cortical strips for 6 days (Step 1) then subsequently isolated at the pre-antral stage and cultured for a further 4 days (step 2) in the presence (A and B) or absence (C and D) of 100 ng/ml of activin A. TISSU FRAIS Telfer, E. E. et al. Hum. Reprod : ; doi: /humrep/den070 Copyright restrictions may apply.

46 Préserver la fertilité féminine ?
BALANCE: Altération de la fertilité par le traitement Altération de la fertilité par le prélèvement d’ovaire (ovariectomie unilatérale ne divise pas le stock par deux) Conjoint ? Désir d’enfants ? Associer les différentes techniques Congélation cortex ovarien Congélation ovocytes immatures (follicules antraux) Enfant : information aux parents