Compter des Microorganismes

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1 Compter des Microorganismes

2 Méthodes Comptes viables Nombre le plus probable Comptes directs

3 Nombre le Plus probable: NPP
Fondé sur les statistiques de probabilités Test présomptif fondé sur des caractéristiques données Technique en bouillon

4 Nombre le Plus Probable (NPP)
Commencer avec un bouillon pour déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque Dilution dans chaque Tube Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

5 NPP- Suite Les résultats Objectif est de DILUÉ à zero l’organisme
No de tubes (+) Objectif est de DILUÉ à zero l’organisme Choisir la série la moins dilué qui sont tous négatifs Dans cet exemple (-5) Obtenir les résultats des 3 dilutions précédente Dans cet exemple (-2, -3, et -4) Determiner le nombre de tubes positifs pour chacune de ces dilutions Dans cet exemple (3, 2, 1 respectivement) Determiner le NPP sur le tableau de NPP

6 NPP = 1.5 UFC/ml pour la dilution 10-3

7 NPP Calculs Si 3, 2,1 Donc le résultat est: 1.5/ml or g
Puisque ceci est une estimé pour la dilution de 10-3 nous devons multiplier par 1 000 Notre résultat 1.5 UFC/g ou ml 1.5 x 103 UFC/g ou ml

8 Comptes Directes L’échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d’hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

9 Comptes sur Hémacytomètre
Cette lame possède 2 cellules de comptages indépendantes, chacune d’un volume de 0.1 mm3 quand elles sont recouverte d’une lamelle

10 Application à la Lame d’Hémacytomètre
Remplir la cellule avec la suspension a être compté Laisser la cellule se remplir par capillarité Ne pas forcer le remplissage avec de la pression Lamelle

11 Déterminer le Compte Direct
Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants 8, 8 et 5 Déterminer la moyenne ( )/3 =7 Donc 7 cellules/carré

12 Déterminer le Compte Direct (suite)
1mm Depth: 0.1mm 1mm Calculer le volume d’un carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d’un carré Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

13 Avantages: Limitations: Rapide Culture pas nécessaire
Aucune info préalable nécessaire Limitations: Ne distingue pas vivant de mort Difficile de distinguer bactéries de détritus

14 Problème Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame d’hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon original si la cellule de comptage possède 100 carrés?

15 Microscopie Colorations

16 Coloration Différentielle Coloration de Gram
Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives

17 Gram Positives Colorées Bleu Bacille Coccus
Genres Bacillus et Clostridium Coccus Genres Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

18 Gram Négatives Colorées Rouges Bacille: Coccus:
Genres Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. Coccus: Genres Neisseria, Pneumococcus et Meningococcus

19 Paroi Cellulaire Gram + Vs Gram - Paroi Peptidoglycane Membrane
Couche de Lipopolysaccharide Absente Paroi Peptidoglycane Membrane Plasmique

20 Méthode - Coloration Primaire
+ Coloration avec le cristal violet Ajout d’iode de Gram (Mordant) + + Paroi :peptidoglycane LPS Membrane plasmique Gram positif Gram Négatif

21 Méthode - Étape Différentielle
Lavage à alcool Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé Paroi n’est pas déshydratée – Complex n’est pas piégé Paroi :peptidoglycane LPS Membrane plasmique + + Gram positif Gram Négatif

22 Méthode - Contre Coloration
+ Coloration avec la Safranine + + Paroi :peptidoglycane LPS Membrane plasmique + Gram positif Gram Négatif

23 Sommaire Fixation Coloration primaire Violet de cristal Lavage
Décoloration Contre coloration Safranine

24 Coloration Acido-Alcoolo-Résistante
Coloration diagnostique de Mycobactérium Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre Paroi cellulaire avec acide mycoïque

25 Méthode Principe: Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants

26 Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur
Coloration avec de la fuchsine basique Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de l’alcool acide Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant

27 Coloration de Spores Spores: Cellule bactérienne différentiée
Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à l’endospore

28 Coloration au Vert de Malachite
Spores Sporangium Endospore Cellules végétatives Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine