 Saoula Selma  Benhedfa Fatiha  Kihel Chahira  Zeguer Manel La technique SSCP Présenté par : Encadré par : Dr.Yahiaoui.B.

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1  Saoula Selma  Benhedfa Fatiha  Kihel Chahira  Zeguer Manel La technique SSCP Présenté par : Encadré par : Dr.Yahiaoui.B

2  Introduction  Historique  Principe  Matériels et méthode  Les exemples:  Conclusion Plan de travail  Détection moléculaire des bactéries phytopathogénes par :PCR- SSCP  Identification d’espèce d’Aspergillus par polymorphisme conformationnel simple brin(SSCP)

3 Introduction: Les techniques de biologie moléculaire ont évolué au cours des dernières années en applications standard pour une différenciation efficace et rapide des communautés microbiennes en fonction de leur diversité. Ces techniques analysent couramment la diversité des produits de PCR amplifiés à partir d'ADN extrait en utilisant habituellement des amorces s'hybridant à des régions présumées conservées des gènes ciblés. Cet exposé donne une aperçu d'une technique les plus communément employées dans l’étude des populations microbiennes, qui est Le Polymorphisme de conformation des simples brins (Single Strand Conformation Polymorphisme ou SSCP).

4 SSCP ingletrandonformationolymorphisme

5 Historique: Le Polymorphisme de conformation des simples brins (Single Strand Conformation Polymorphisme ou SSCP) est une technique mise au point par Orita et collaborateurs en 1989 dans le cadre de l’analyse du génome humain. La première équipe à l’avoir utilisée pour une étude de population bactérienne est celle de Lee et collaborateurs en 1996 En 1991 Hayashi fait une séparation des différents brins sur un gel de polyacrylamide. En 1999 Nataraj et al utilisent les agents chimiques tell que La formamide pour dénaturer l’ADN double brin. En 2003 Baba et al réalise la séparation par électrophorèse capillaire. Récemment, en 2007 Ye et collaborateurs ont utilisé cette technique pour étudier les effets du pH sur les populations bactériennes lors de la fermentation des composts.

6 principe La SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisme) est une technique de biologie moléculaire simple et efficace pour détecter une petite altération du produit amplifié par PCR. Elle est basée sur la conformation secondaire qu’adopte un fragment d’ADN simple brin en conditions non- dénaturantes.cette conformation est dépendante de sa structure primaire (séquence).  Avant l’utilisation de la technique SSCP, il faut tout d’abord extraire l’ADN présent dans un écosystème suivie par une étape d’amplification des fragments d’ADN ( >200 pb) par PCR.  Dénaturation par la chaleur ou le formamide pour séparer les 2 brins.  Refroidissement brutal pour maintenir la séparation des 2 brins d’ADN.  Migration sur gel de polyacrylamide non dénaturant.  Analyse l’éléctophorégramme (population des pics).

7  le thermocycleur  Taq polymérase  Des amorces oligonucleotidiques  dNTP  ADN génomique purifie  Plaque chauffante ou bain d'eau bouillante  Un tampon de dénaturation contient Xylène cyanol/Formamide  Appareil de gel de polyacrylamide  Solution mère d’acrylamide,Glycérol, Tetramethyle Diamine(TEMED), Persulfate d’amonniume (APS) Tris base d’acide purique(EDTA, PH8) Dénaturation de l'échantillon Gel d’électrophorèse PCR matériels

8  Solution de coloration : nitrate d'argent.  Solution de fixation: carbonate de sodium.  Solution de lavage: d'éthanol, d’acide acétique. Coloration d'argent Toutes les solutions doivent être préparée immédiatement avant utilisation.

9 Méthode PCRSSCP Dénaturation de l'échantillon L’électrophorèse Visualisation des bandes  Fixation d’ADN par carbonate de sodium.

10 Exemple 1 D’application Concrète Identification d'espèces d'Aspergillus médicalement importantes par polymorphisme conformationnel simple brin (SSCP) de la région espaceur intergénique amplifiée.

11 Condition de culture et l’extraction de l’ADN Culture en bouillonCulture solide  Mettre les conidies âgées récoltes dans une solution de NaCl avec le Tween 20.  100µl de suspension est inoculé avec 5µl de dextrose Sabouroud(DS) (35°C/24h).  Homogénéisation et lavage de tapis de mycélium a l’aide de bille de verre.  L'ADN a été extrait par phénol -chloroform suivi d'une précipitation dans de l'éthanol à 96%.  Puis mettre dans un tampon TE..  Détermination de la concentration de l’ADN par les Kit DNA Dipstick.  appliquer les conidies sur gélose Sabouroud et les incubées (24h à 35 ˚c)  un morceau d’agar a été découpé, lavé par l’eau distillé stérile  Extraction de l’ADN par le Kit de tissus Quiagen. Les souches Souches de références Souches analysées A. fumigatus8 souches16 souches A. flavus8 souches14 souches A. nidulans5 souches7 souches A. niger4 souches10 souches A. terreus2 souches8 souches totale27 souches55 souches Souches d'Aspergillus : Matériels et méthodes  après centrifugation le culot obtenu est lavé par l’éthanol.  sécher à l’aire et mis en suspension avec le tampon TE.

12 PCR-SSCP L'amplification de l'ADN par PCR Analyse SSCP  les produits de PCR est mélangée avec tampon d’échantillon ( tris, EDTA, bleu de bromophénol, xylencyanol ) et avec un tampon de dénaturation (formamide).  Séparer le mélange dans un gel acrylamide –bisacrylamide  l'électrophorèse est réalisée dans une chambre Mighty Small-SE  Visualisation des bandes par coloration d’argent ou par le bleu de méthylène  La suspension a été brièvement vortexée, incubée pendant 10 minutes à 95 ° C et refroidie par congélation sur la glace

13 La technique SSCP pour la discrimination des espèces a été testée en utilisant les produits de PCR des 27 souches de la collection de culture. Après optimisation des conditions de séparation, une différenciation nette des cinq espèces d’Aspergillus a été obtenue(figure1). Figure 1: Schémas de la SSCP de 27 souches de la collection de culture d'Aspergillus après amplification par PCR. Le produit de PCR a été séparés sur gel d'acrylamide et colorés avec du bromure d'éthidium. Résultats

14 Des variations mineures dans les profils de SSCP ont été observées chez les espèces A. fumigatus (type fuA et fuB) et A. flavus (type flA et flC).Lors de l'étude de 55 souches provenant de patients et de l'environnement, la différenciation des espèces a été confirmée. Un type supplémentaire de (flB) a été trouvé dans A. flavus (figure 2-a). Figure 2. Schémas SSCP colorés à l'argent de souches représentatives d'Aspergillus après amplification de PCR avec les amorces ITS 1 et ITS 4. Dans (a) les variations des profils SSCP dans les espèces A. fumigatus (fuA; fuB) et A. flavus (flA, flB, flC) est montrée. Dans (b) chaque patrons SSCP représente un espèce particulière d’Aspergillus( A. fumigatus (1), A. flavus (2), A. niger (3), A. nidulans (4) et A. terreus (5)., ADN Lambda digéré par Hind III; M, marqueur interne.

15 Exemple 2 D’application Concrète Détection moléculaire des bactéries phytopathogènes à l'aide d'un PCR-SSCP.

16 Matériaux et méthodes  Isolement des bactéries phytopathogènes à partir des plantes infectées : Axonopodis pv. Vesicatoria, Ralstonia solanacearum, Xanthosomas oryzae pv. Oryzae.  Un dépistage en laboratoire par méthodes d'analyse de la santé des semences : Le placage direct  Stériliser les échantillons de semences avec l’hypochlorite de sodium 2%. suivi par Lavage répété avec l’eau distillé stérile. le dosage liquide  plaquer sur le milieu Tween B et Incuber 28°c/24à48h.  Stériliser les échantillons de semences comme mentionné précédemment.  Après cela, ils ont été macérer en utilisant un mortier stérile dans 10 ml d’eau distillé stérile.  Un millilitre du surnageant était mélangé avec 9 ml d'eau distillée stérile pour obtenir une dilution de 10 _1  puis faire une séries de dilution jusqu'à 10 _5.  Cinquante microlitres de chaque dilution ont été étalés sur milieux semi-sélectifs utilisant des épandeurs Drigalski en triple.  Les plaques ont été incubées à 28 ° C /24 à 48 h.

17 PCR-SSCP Extraction d'ADN L'amplification de l'ADN par PCR Analyse SSCP  les amplicons de PCR a été mélange avec un tampon de dénaturation qui contient 95% de formamide  Les mélanges ont été chauffés à 98 ° C pendant 10 minutes et ensuite refroidir.  colorer le gel par le nitrate d’argent.  rinçage par le formaldéhyde.  fixation par l’ acide acétique.  Puis capturer l’image pour la documentation et la comparaison entre les espèces.  L'ADN bactérien a été isolé en utilisant kit d'isolement d'ADN génomique bactérien de Bangalore GeNei.  La PCR a été réalisée dans un Thermocycleur à gradient maître Eppendorf.  Il était effectué dans un tube PCR contenant d'ADN génomique, deux amorces (amorce directe, amorce inverse ), de dNTP, tampon de PCR et Taq Polymérase (BangaloreGeNei).  le produit PCR dénaturée est charger sur gel d’acrylamide bisacrylamide non dénaturant contient Tampon TBE.

18 Résultats Détection de R. solanacearum, X. axonopodis pv. Vesicatoria, et X. oryzae pv. Oryzae utilisant un profil d'ARNr 16S via PCR-SSCP :  Les amorces d'ARNr 16S ont été utilisées pour amplifier l'ADN bactérien testé dans tous les isolats positifs respectifs pour confirmer les pathogènes. Le produit PCR de 210 pb a été obtenu dans tous les isolats incluant la bactérie E. coli (Figure 1), tandis que l'ADN végétal non infecté et le témoin négatif n'ont montré aucune amplification. Figure 1 Produits de PCR de différentes bactéries phytopathogènes R. solanacearum (pistes 1 et 2); X. axonopodis pv. Vesicatoria (voies 3 et 4); X. oryzae pv. Oryzae (voies 5 et 6) et E. coli (voies 7 et 8), témoin négatif (piste 9) et ADN végétal non infecté (piste 10), marqueur d'ADN de 100 pb (M), sur gel d’agarose.  Les motricités de l'ADNsb de toutes les bactéries testées ont un profil spécifique à l'espèce (figures 2-4). Figure 2 Schéma des bandes PCR-SSCP des isolats de R. solanacearum L'ADN a été isolé, la PCR-SSCP a été réalisée et les profils de bandes ont été visualisés sur des gels de polyacrylamide non dénaturants. Les isolats 1-40 sont des isolats différents de R. solanacearum. Marqueur ssDNA (SL).

19 Figure 3 Schéma des bandes PCR-SSCP de X. axonopodis pv. Vesicatoria Figure 4 Schéma de bandes PCR-SSCP de X. oryzae pv.  L'électrophorèse des produits de dénaturation de 210 pb a donné deux bandes principales pour R. solanacearum, trois bandes principales pour X. axonopodis pv. Vesicatoria, et deux bandes principales pour X. oryzae pv. Oryzae, et E. coli a également montré la bande différente, ce qui prouve la sensibilité et la spécificité de la technique PCR-SSCP. La distance entre les bandes supérieures et inférieures variait selon les espèces. Ces variations constituaient des schémas SSCP simples et distincts pour des espèces individuelles. Ces résultats ont indiqué que la mobilité des molécules au cours de l'analyse SSCP était distincte pour chaque espèce des genres de bactéries testées (figure 5). La figure 5 PCR-SSCP motif de bandes de différentes bactéries phytopathogènes avec les bactéries non pertinentes et le contrôle négatif.

20 conclusion Contrairement aux technique classique de la biologie moléculaire, cette technique basé sur l’extraction du matériel génétique des organismes, permet ainsi de comparer rapidement et d’une manière simple des microflores entre elle sans mise en culture. La technique SSCP a trois avantages principaux :  Mettre en évidence des mutations ponctuelles au niveau d’un gène  visualisation un grand nombre d'échantillons.  Les bandes d’intérêt peuvent être excisées du gel. Malgré l’importance de cette approche, la SSCP comporte deux inconvénients majeurs :  le comportement électro phorétique des fragments simple brin est imprévisible (très dépendant de la température et des conditions d’électrophorèse)  utiliser pour les fragments assez grands (supérieure à 200pb).