ELISA.

Présentation au sujet: "ELISA."— Transcription de la présentation:

1 ELISA

2 Principe d’une réaction ELISA Technique la plus courante
ELISA: enzyme-linked-immunosorbent-assay, est une méthode immuno-enzymatique qui permet de doser avec une bonne sensibilité des anticorps ou des antigènes. Elles reposent sur l’utilisation d’une enzyme pour déceler les complexes immuns.

3 application d’une réaction ELISA Technique la plus courante
Les techniques ELISA sont très utilisées en : Dosage des protéines : la ß2m, drogues, hormones (insuline, glucagon…), médicaments, enzymes (énolase, lipase…), les facteurs rhumatoïdes, vitamines, IgE… Diagnostic sérologique : parasitaire, bactériologique par titrage d’anticorps ( Brucella, Salmonelle, Treponema…), virologique (HIV,rubéole, hépatite A-B, varicelle, herpés, grippe…), Maladies auto-immunes : recherche et dosage des Ac anti-ADN, anti-histones …

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5 Méthode indirecte 1 - Habillage (coating) avec l’antigène
2 - Anticorps primaire 3 - Anticorps secondaire marqué 4 - Révélation enzymatique

6 Plaque de microtitration
Méthode « sandwich » Plaque de microtitration Détail d’un puits 1 - Habillage (coating) avec un anticorps anti-antigène 2 – Solution contenant l’antigène 3 - Anticorps anti-antigène marqué 4 - Révélation enzymatique

7 différentes dilutions de l’antigène
Quelques applications du test ELISA compétitif : Test de spécificité par compétition 10 1000 [ ] DO 1 - Habillage (coating) avec l’antigène 2 - Préincubation anticorps primaire + différentes dilutions de l’antigène 2 - Préincubation anticorps primaire + antigène (en tube) 3 - Transfert et incubation en plaque ELISA) Lavage 4 - Anticorps secondaire marqué 5 - Révélation enzymatique

8 Les conjugués Un conjugué est un anticorps couplé à une protéine:
conjugué classique: anticorps couplé à une enzyme

9 conjugué à la biotine et à l'avidine (ou streptavidine): l'anticorps est couplé à la biotine de façon covalente et l'enzyme sera conjuguée à l'avidine. L'avidine a une forte capacité de se lier à la biotine. L'intérêt est que l'avidine peut fixer plusieurs biotines, ce qui permet d'amplifier le signal par rapport à un conjugué classique.

10 Système de révélation Couplée à un Ac ou un Ag. En fonction du substrat, le produit de la réaction est mesuré par spectrophotométrie, colorimétrie (examen visuel) ou par fluorométrie.

11 Comparaison des mécanismes réactionnels de différentes techniques
Traceur Anticorps secondaire Anticorps primaire Antigène Plaque de polystyrène Feuille de nitrocellulose Echantillon ICC ELISA IMMUNO-BLOT

12 ELISA, exemple : "titrage" de 12 antisérums
Antisérum n° 1……………………………………. 12 1/dilution : 100 1000 10 000