Mise au point d'un test de quantification colorimétrique de cellules

Présentation au sujet: "Mise au point d'un test de quantification colorimétrique de cellules"— Transcription de la présentation:

1 Mise au point d'un test de quantification colorimétrique de cellules
TP BioCell 03 TEST MTT  Mise au point d'un test de quantification colorimétrique de cellules Test de cytotoxicite  titre

2 1. Obtention d’une suspension ajustée.
plan

3 plan 1. Obtention d’une suspension ajustée.
Rincer les cellules deux fois avec du PBS stérile. Ajouter de la trypsine-EDTA en quantité suffisante pour décoller les cellules. (environ 1 ml) plan Ajouter 3 ml de milieu complet et récupérer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger.

4 plan 1. Obtention d’une suspension ajustée.
Centrifuger à rpm pendant 5 mn puis jeter le surnageant en prenant garde de ne pas décoller le culot cellulaire. Reprendre le culot avec 1 ml de DMEM et homogénéiser doucement avec une pipette. plan Quand la suspension est homogène réaliser un test de viabilité au bleu Trypan - Diluer 0,05 mL de culture dans 0,2 mL de solution de bleu Trypan dilué au 1/10 en PBS - Compter à l'hématimètre

5 plan 2. Quantification colorimétrique des cellules (test MTT).
2.1. Influence du temps d’incubation. A partir de la suspension préparée, distribuer en double essai, dans deux barrettes 16 puits, les quantités de cellules calculées précédemment: Placer les cellules 30 minutes à 37 °C dans l'étuve à CO2 à 5 % plan Réaliser en Al à A4 les tests témoins pouvant servir de blanc optique. Distribuer 10 µL de solution de MTT dans les 4 rangées. MTT Incuber les cellules pendant 30 ou 60 minutes à 37 °C dans l'étuve à CO2 à 5 %. Après incubation, éliminer le milieu dans le récipient d'eau de Javel. 30 mn 60 mn Ajouter 100 µl de DMSO et agiter 10 minutes. Lecture de l'absorbance à 540 nm.

6 plan 2. Quantification colorimétrique des cellules (test MTT).
2.2. Etude de la sensibilité de la lignée au réactif HAT. La barrette fournie contient: - les cellules à tester - le milieu HAT Distribuer 10 µL de solution de MTT dans les deux rangées. plan Incuber les cellules 1h à 37 °C dans l'étuve à C02 à 5 % MTT Après ce délai, éliminer le milieu dans le bac de Javel. Ajouter 100 µl de DMSO et agiter 10 minutes. Lecture de l'absorbance à 540 nm.