RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université Kasdi Merbah Ouargla Faculté.

Présentation au sujet: "RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université Kasdi Merbah Ouargla Faculté."— Transcription de la présentation:

1 RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université Kasdi Merbah Ouargla Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département : Sciences Biologiques Niveau : Licence MicrobiologieMatière Systématique des procaryotes Enseignant : Mme BEN ISSA Etudiantes du groupe : A.Lyna B.Meriem Sonia Kh.noussaiba M,khanssa B, Soumia A,Souhila

2 introduction Définition de la PCR Les étapes de PCR RT-PCR Conclusion Les Application de PCR TERMOCYCLEUR Les besoins d’initiation de laPCR

3 INTRODUCTION En 1993, Kary Mullis est lauréat de la moitié du prix Nobel de chimie «pour des contributions au développement de méthodes en chimie de l'ADN, et pour son invention de la méthode de réaction en pour son invention de la méthode de réaction en chaîne par polymérase ». L'autre moitié a été remise à Michael Smith un biochimiste canadien d'origine anglaise, pour la découverte de la mutagenèse dirigée (l'induction d'une ou plusieurs mutations dans un génome, de façon précise et volontaire.) * *

4 Définition La PCR « Polymérase Chain réaction» ou en français Amplification en chaine par polymérase. La PCR permet de recopier un segment d’ADN des million de fois, grâce à un appareil (thermocycleur) qui contrôle les changements de températures différentes étapes de la réaction: 1-Température de dénaturation 2-Température d’hybridation 3-Température d’extension

5 Le Termocycleur est alors programmé pour effectuer les différents cycles la PCR ainsi Chaque cycle est composé d’une succession de paliers de Température et temps dépendent de taille de la séquence a amplifier et de composition en déxoscynucléotides des amorce

6 TamponTaq polMg++ DATP+DTTP+DGTP+ DCTP Amorce

7 Les étape de la PCR :

8 La première période s’effectue à une température de 94°C, dite température de dénaturation. À cette température, l’ADN matriciel, qui sert de matrice au cours de la réplication, est dénaturé : les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à une température supérieure à 80°C et les ADN double-brin se dénaturent en ADN simple- brin (ADN monocaténaires).

9 La deuxième période s’effectue à une température généralement comprise entre 40 et 70°C, dite température d’hybridation des amorces. La diminution de la température permet aux liaisons hydrogène de se reformer et donc aux brins complémentaires de s’hybrider. Les amorces, courtes séquences monocaténaires complémentaires de régions qui flanquent l’ADN à amplifier, s’hybrident plus facilement que les longs brins d’ADN matriciel. Plus la température d’hybridation est élevée, plus l’hybridation est sélective, plus elle est spécifique.

10

11 *La Taq polymérase (aussi appelée « Taq pol » ou simplement « Taq ») est une variété d'ADN polymérases thermostables nommée d'après Thermus aquaticus, une bactérie thermophile à partir de laquelle cette enzyme a été isolée pour la première fois en 1969. Sa demi-vie enzymatique à 95 °C est de 40 minutes. *Elle est dépourvue d'activité exonucléasique, ce qui rend donc impossible la correction d'erreur lors de la copie. *Certains mauvais résultats de la PCR (faux négatifs5) sur certains échantillons d'ADN (notamment provenant de l'urine ou de crachats), pourraient être dus à un inhibiteur de cette enzyme présent dans l'urine, mais non dans le sang. *Cette enzyme est utilisée en biochimie pour faire des réactions de PCR. *La Taq polymérase (aussi appelée « Taq pol » ou simplement « Taq ») est une variété d'ADN polymérases thermostables nommée d'après Thermus aquaticus, une bactérie thermophile à partir de laquelle cette enzyme a été isolée pour la première fois en 1969. Sa demi-vie enzymatique à 95 °C est de 40 minutes. *Elle est dépourvue d'activité exonucléasique, ce qui rend donc impossible la correction d'erreur lors de la copie. *Certains mauvais résultats de la PCR (faux négatifs5) sur certains échantillons d'ADN (notamment provenant de l'urine ou de crachats), pourraient être dus à un inhibiteur de cette enzyme présent dans l'urine, mais non dans le sang. *Cette enzyme est utilisée en biochimie pour faire des réactions de PCR.

12 La troisième période s’effectue à une température de 72°C, dite température d’élongation. À 72°C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel. Les régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées. La troisième période s’effectue à une température de 72°C, dite température d’élongation. À 72°C, la Taq polymérase se lie aux ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les désoxyribonucléosides triphosphates présents dans le mélange réactionnel. Les régions de l’ADN matriciel en aval des amorces sont ainsi sélectivement synthétisées.

13

14 Le couple d’amorce de 2éme cycle est identique à celui de 1 er n cycle de PCR permettent en théorie de produire 2n copies de séquence ciblée (amplicon) Il est possible d’obtenir plus d’un million de copies de la séquence d’ADN recherchée en une vingtaine de cycles

15

16 Définition : est une technique qui associe une transcription inverse (RT) suivie d’une PCR. Elle permet de synthétiser le brin complémentaire d’un ARN avec des désoxyribonucléotides en utilisant une ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase inverse). Cet ADNc est généralement destiné à être amplifié par PCR (l'ADNc étant plus stable, il permet plus de liberté que les ARN pour les analyses suivantes ).

17 Les étapes de RT-PCR  La RT-PCR se déroule en deux phases. Une première phase correspond à la copie d'ARN messager en ADN complémentaire (ADNc) et une seconde phase correspond à une réaction PCR classique sur le ADNc synthétisé.  Dans la première phase, l'ARN messager à étudier est répéré en utilisant une sonde oligonucléotidique spécifique (amorce 1 qui s'hybride à l'extrémité 3' du seul mARN auquel on s'intéresse), puis la transcriptase inverse (ou rétrotranscriptase) permet la synthèse du brin complémentaire (sous une forme de ADNc simple brin), une seconde amorce oligonucléotidique spécifique (amorce 2) permettra la synthèse du second brin par extension.  L'ADN complémentaire synthétisé servira ensuite de matrice pour une réaction PCR classique.

18 En médecine :  En parasitologie (toxoplasmose).  En bactériologie (tuberculose)  En virologie (Sida, Hépatite C, SRAS).  En maladies génétiques (myopathie, mucoviscidose).  En oncologie. En médecine légale :  Pour identifier une personne par son empreinte génétique dans le cadre d’une enquête judicaire.  Pour un test de paternité.

19  pour identifier des variétés ou des espèces végétales et animales,  pour sélectionner de nouvelles variétés de fruits et légumes, comme la tomate  pour le contrôle de la qualité des produits agroalimentaires, détecter la présence d’OGM dans un aliment par exemple.

20 Grâce à son universalité, la PCR a conquis une place prépondérante en biologie moléculaire et concerne en particulier, tous les aspects de la biologie moléculaire appliquée à la médecine. Son apparition a représenté un progrès méthodologique décisif.