Culture de cellules et de tissus

Présentation au sujet: "Culture de cellules et de tissus"— Transcription de la présentation:

1 Culture de cellules et de tissus
Page Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

2 Culture de cellules et de tissus
Page Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

3 Culture de cellules et de tissus
Page XXe siècle : culture de tissus Perfectionnement de la technique 1950: Culture de cellules Trypsinisation (trypsine)

4 Culture de cellules et de tissus
Page 43 Culture de tissus ? Le terme général englobant le prélèvement de cellules, tissus ou organes d’un animal ou d’une plante et leur placement ultérieur dans un environnement artificiel (in vitro) conduisant à leur croissance (mitoses)

5 Culture cellulaire Définition:
Page 43 Définition: Le maintien en dehors de l’organisme (in vitro), des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser et d’exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques.

6 Techniques d’obtention
Culture cellulaire Pages 2 types de cellules: Libres et circulantes (¢ sanguines) Prélèvement et centrifugation En cohésion entre elles (tissu) Explants ou digestion enzymatique Techniques d’obtention Avantages et inconvénients

7 Culture cellulaire Les méthodes de culture:
Page 44 Les méthodes de culture: Culture stationnaire ou monocouche Affinité des ¢ au support (plastique ou verre) ↑ Rendement Culture en suspension

8 Culture cellulaire Contrôler la fonctionnalité: La prolifération ¢
Page 44 Contrôler la fonctionnalité: La prolifération ¢ Préservation des fonctions spécialisées

9 Culture cellulaire Evolution in vitro: La prolifération ¢
Page 44 Evolution in vitro: La prolifération ¢ Préservation des fonctions spécialisées Ok mais elle peut ralentir Modification et disparition (dédifférenciation)

10 Culture de cellules et de tissus
Page Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

11 Culture de tissus végétaux
Page 45 In vitro Cultures d’explants de plantes - milieu synthétique - conditions stériles - environnement contrôlé - espace réduit = matériel végétal de base qui servira à produire un clone - morceau de feuille - morceau de tige - un bourgeon - … ¢ végétales

12 Culture de tissus végétaux
Page 45 In vitro ? Cultures d’explants de plantes ? = matériel végétal de base qui servira à produire un clone - morceau de feuille - morceau de tige - un bourgeon - … ¢ végétales

13 Culture de tissus végétaux
Page 45 Les cellules végétales - Totipotentes ¢ végétales différenciées → indifférenciées → se divisent activement → se différencient → ¢ différentes Toutes les ¢ végétales sont capables d’exprimer toutes les informations génétiques contenues dans l’ADN. ≠ ¢ animales

14 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 1: Prélèvement de cellules isolées ou de tissus dans une feuille ou un autre organe.

15 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 2: Le prélèvement est déposé sur un substrat nutritif → maintien en vie = tissu biologique c ¢ indifférenciées → zone de croissance

16 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 3: Stérilisation de la surface du tissu prélevé Etape 4: Fragments de tissu déposés sur un milieu nutritif solidifié avec de l’agar-agar

17 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Si le tissu est dépourvu de chloroplastes (= hétérotrophe) Le milieu doit contenir - Sels minéraux - Sucre (saccharose ou glucose)

18 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Hormones végétales = phytohormones - Auxines - Cytokinines Mitoses

19 Culture de tissus végétaux
Pages Technique = masse cellulaire c amas de ¢ indifférenciées

20 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 5: Le cal est mis en suspension (milieu liquide) → dissociation des ¢ calleuses

21 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 6: Filtration à travers une gaze→ ¢ calleuses

22 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 7: ¢ calleuses → culture

23 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 8: ¢ calleuses → culture → masse cellulaire

24 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 9: ¢ calleuses → culture → masse cellulaire → cal

25 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 10: Clonage des ¢ calleuses → ↑ rendement Le clonage est d’abord une stratégie de reproduction naturelle (fraisier; pomme de terre; jonquilles…)

26 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 11: Variation et combinaison [phytohormones] → formation organes.

27 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 12: Formation de tiges

28 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 13: Les plantules présentent des radicelles (petites racines) et des petites feuilles.

29 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 14: Transplantation des plantules dans des pots

30 Culture de tissus végétaux
Pages Technique Etape 15: Développement → plante mature

31 Culture de tissus végétaux
Cellule végétale: = protection → barrière aux échanges d’information génétique

32 Culture de tissus végétaux
Page 46 Tissu végétal: Comment peut-on séparer les cellules d’un tissu végétal ? Enzymes : pectinases et cellulases (champignons) → protoplastes = ¢ sphériques sans paroi

33 Culture de tissus végétaux
Page 46 Protoplastes: Agents stabilisants Utilisation expérimentale comme les ¢ animales Transfert direct de gènes (PEG; électroporation; microinjection)

34 Culture de tissus végétaux
Page 44 Protoplastes: Conditions favorables 1.- Reconstitution de la paroi pectocellulosique 2.- Réarrangement des organites 3.- Divisions cellulaires → microcolonies → cals

35 Culture de tissus végétaux
Page 46 Pas chez toutes les espèces végétales Cals Plantules Milieu de régénération Embryons somatiques

36 Culture de tissus végétaux
Page 46 Protoplastes: Toutes les espèces végétales Régénération de plantules → toutes les espèces Monocotylédones (céréales) Dicotylédones

37 Culture de tissus végétaux
Page 46 Cotylédon(s) = feuille(s) primordiale(s) constitutive(s) de la graine.

38 Culture de tissus végétaux
Page 46 Protoplastes: Toutes les espèces végétales Régénération de plantules → toutes les espèces Monocotylédones (céréales) Dicotylédones NON OK

39 Culture de tissus végétaux
Pages Utilisations des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique

40 Culture de tissus végétaux
Pages Utilisations des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique

41 Culture de tissus végétaux
Pages 46-47 L’hybridation somatique: = fusion des protoplastes (noyaux et cytoplasmes) - où ? - avantage ? - but ? Milieu approprié Surmonter barrières de la reproduction sexuée → espèces différentes (genre) Créer de nouvelles combinaisons ↑ productivité

42 L’hybridation somatique
Page 47 Exemples de genres utilisés: Petunia Daucus Carotte Solanum Pomme de terre, tomate, aubergine… Croiser des espèces → combiner plusieurs qualités - résistances - fixation d’azote atmosphérique → ↑ productivité

43 L’hybridation somatique
Page 47 Première expérience (1978) But: Solanum Tomate x pomme de terre = pomate → stérile tomates cultivables à basse température

44 L’hybridation somatique
Page 47 Technique (tabac): Centrifugation Sélection des hybrides

45 L’hybridation somatique
Page 47 Autres expériences: Solanum tuverosum = Pomme de terre cultivée - Introduction de gènes de résistance - à certains virus - au mildiou - à la pourriture bactérienne X Solanum brevidens (A. Sud)

46 L’hybridation somatique
Page 47 Autres expériences: Stérilisation mâle chez le colza et résistance à l’atrazine (herbicide)

47 L’hybridation somatique
Page 48 Comment peut-on faire fusionner les protoplastes (anions) ? Agents chimiques: 1.- Ca2+ et pH élevé → neutralisation charge électrique 2.- PEG → agrégation des ¢ + déstabilisation m.p → fusion Electrofusion: Champs électriques intenses de courte durée → déstabilisation m.p. → fusion + + +

48 L’hybridation somatique
Page 48

49 L’hybridation somatique
Pages Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

50 L’hybridation somatique
Pages Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

51 Fusion noyaux et cytoplasmes
Page 48 Fusion noyaux: Recombinaison + ou – importante entre chromosomes parentaux → transfert de gènes nucléaires Si recombinaison + + + → stérilité (pomate) Si recombinaison + → quelques fragments (asymétrique)

52 Fusion noyaux et cytoplasmes
Page 48 Fusion noyaux: Recombinaison + ou – importante entre chromosomes parentaux → transfert de gènes nucléaires Si recombinaison + + + → stérilité (pomate) Si recombinaison + → quelques fragments (asymétrique) Comment favoriser le transfert partiel ? En déstabilisant par irradiation l’ADN du donneur avant la fusion.

53 Fusion noyaux et cytoplasmes
Page 48

54 L’hybridation somatique
Page 48 Tous les échanges sont possibles: Fusion des noyaux et des cytoplasmes Fusion des cytoplasmes

55 ADN mitochondriale et chloroplastique
Fusion cytoplasmes Page 48 = les cybrides: Fusion des noyaux → 1 noyau après mitoses + cytoplasme recombiné Mitochondries Recombinaison Chloroplastes Recombinaison, 1 seul type ADN mitochondriale et chloroplastique Modifications des relations nucléo-cytoplasmiques

56 Fusion cytoplasmes Obtention provoquée des cybrides:
Pages 48-49 Obtention provoquée des cybrides: Irradiations létales → ¢ du parent donneur → inactivation du noyau → transfert des mitochondries et des chloroplastes uniquement

57 Fusion cytoplasmes Obtention provoquée des cybrides:
Page 49 Obtention provoquée des cybrides: En plus, traitement à l’iodo-acétate → ¢ du parent receveur → inactivation des organites → transfert du noyau uniquement Cybrides c noyau (receveur) + organites (donneur)

58 Les hybrides retenus Page 49

59 Culture de tissus végétaux
Page 49 Applications des protoplastes: L’hybridation somatique La transformation génétique = transfert direct d’ADN dans les ¢

60 Culture de cellules et de tissus
Pages Culture cellulaire Cultures de tissus végétaux Cultures de tissus animaux

61 Culture de cellules Culture primaire Culture secondaire
Page 50 Culture primaire ¢ proviennent directement d’un tissu ou d’un organe Culture secondaire ¢ proviennent de la culture primaire ( ↑densité)

62 Obtention de ¢ hybrides
Pages 50-51 = ¢ à deux noyaux Etudier les interactions entre les constituants cellulaires provenant de cellules différentes ¢ animale x ¢ tumorale → perte de chromosome humain → observer perturbations → attribuer un gène à un chromosome

63 Culture de cellules Page 51 Fusion cellulaire → cellules hybrides (2 parents différents) 1975: création de ¢ capables de produire des anticorps monoclonaux = anticorps issus d’un seul clone de plasmocytes, reconnaissant qu’un seul type d’épitope sur un antigène donné, donc très spécifique.

64 Anticorps monoclonaux
Page 51

65 Anticorps monoclonaux
Page 51 Fusion cellulaire: ¢ de myélome x un lymphocyte B hybridome Un type de cellule cancéreuse possédant la machinerie pour fabriquer des anticorps

66 Anticorps monoclonaux
Page 51 Hybridome: → lignée cellulaire immortelle

67 Anticorps monoclonaux
Page 51

68 Sélection des hybridomes
Page 52 Après la fusion 3 sortes de ¢: Les ¢ de myélome non fusionnées ou fusionnées entre elles. Les plasmocytes non fusionnés ou fusionnés entre eux. Les hybridomes.

69 Sélection des hybridomes
Page 52 Sur un milieu de culture spécifique (HAT) (HAT = Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine) Les ¢ de myélome utilisées sont des ¢ qui, par sélection génétique, ont perdu la faculté de produire une enzyme impliquée dans la synthèse de nucléotides. Enzyme, la ¢ ne peut pas vivre dans ce milieu.

70 Sélection des hybridomes
Page 52 Donc Les ¢ de myélome non fusionnées ou fusionnées entre elles meurent. Les plasmocytes non fusionnés ou fusionnés entre eux meurent après qqs jours Les hybridomes survivent.

71 Sélection des anticorps monoclonaux
Page 52 1.- On isole au hasard qqs hybridomes → culture séparée

72 Sélection des anticorps monoclonaux
Page 52 2.- Les ¢ se divisent durant qqs jours → clone d’hybridomes → un type d’anticorps monoclonaux 3.- Les anticorps se trouvent dans le surnageant 4.- Vérifier compatibilité des anticorps avec l’antigène.

73 Anticorps monoclonaux
Pages 50 / 52 Réaction immunitaire humaine Solution ?

74 Anticorps chimériques « humanisés »
Comment ? Anticorps de souris

75 Anticorps chimériques « humanisés »
Page 52 Modifications génétiques (1984) C de souris → C humaines V de souris Réponse immunitaire humaine

76 ↓ Réponse immunitaire humaine
Anticorps humanisés Page 52 Modifications génétiques (1990) Région hypervariables de la souris → contact étroit avec l’antigène ↓ Réponse immunitaire humaine ↓ affinité

77 Application des anticorps monoclonaux
Page 52 Outils de diagnostic Thérapeutiques

78 Application des anticorps monoclonaux
Page 52 Outils de diagnostic Thérapeutiques

79 Application des anticorps monoclonaux
Page 52 Outils de diagnostic Détecter la présence de virus (hépatite B, herpés, SIDA) Détecter la présence de bactéries Détecter la présence de ¢ tumorales

80 Application des anticorps monoclonaux
Page 52 Outils de diagnostic Thérapeutiques

81 Application des anticorps monoclonaux
Page 52 Thérapeutiques On conjugue les anticorps avec Isotope radioactif → irradiation ciblée des ¢ tumorales en épargnant les tissus sains. Toxine → pour cibler et détruire des ¢ cancéreuses Bloquer un agent infectieux (récepteur cellulaire)