Expression du Génome Le transcriptome.

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1 Expression du Génome Le transcriptome

2 Déchiffrage de l’Information Génique
L’information est encodée dans la séquence de nucléotides contenus dans des unités discrètes Les gènes L’information contenue dans les gènes est transcrite pour générer les ARNs puis décodée pour générer les protéines

3 Les Gènes Seulement un des deux brins d’un gène est codant! Exons
Site d’initiation de la transcription Region 3’ nontraduite Region 5’ nontraduite Introns Promoteur/ Region régulatrice 5’ Séquence de terminaison 3’ Transcrit d’ARN Exon 2 Exon 3 Int. 2 Exon 1 Int. 1 Exons Seulement un des deux brins d’un gène est codant!

4 Codant Brin Codant Brin positif Brin sens
Brin complémentaire à la matrice Brin dont la séquence est la même que celle de l’ARN transcrit 4

5 Non Codant Brin non Codant Brin négatif Brin anti sens Brin matrice
Brin dont la séquence est complémentaire à celle de l’ARN transcrit Brin sur lequel se retrouve le promoteur 5

6 Codant Vs Non-codant ADN: 5’ TAG 3’ 3’ ATC 5’ Transcription ARN: ? 5’
Traduction Leu Protéine: Code génétique: CUA = Leu UAG = Arrêt

7 Transcription - Traduction
Brin matrice 3’ Brin codant 5’ Brin sens 5’ NH3— — COOH

8 ORFs Toutes les séquences double brins ont jusqu’à 6 cadre de lectures
GCCGATTAGAGA> TGCCGATTAGAG> ATGCCGATTAGA> 5’-ATGGCGATTAGAGACAGCCATTAA-3’ 3’-TACTGCTAATCTCTGTCGGTAATT-5’ <CTGTCGGTAATT <TCTGTCGGTAAT <CTCTGTCGGTAA Combien d’ORFs est-ce que cette séquence possède?

9 Répertoire d’ARN des gènes qui codent pour des protéines
Génome Transcription Transcriptome Répertoire d’ARN des gènes qui codent pour des protéines Répertoire d’ARN qui représente la fraction du génome qui est exprimée Traduction Protéome Répertoire de protéines dérivées du transcriptome

10 Un Génome Le transcriptome est-il le même dans toutes les cellules d’un organisme? Le transcriptome est-il toujours le même dans une cellule donnée?

11 Est-ce qu’une Séquence Code pour un Transcrit?
Analyse d’hybridations northern  RT-PCR 

12 Comparaison des Méthodes
Northern RT-PCR Séquence doit être connue Non Oui Présence ou absence d’un transcrit Oui Oui Permets de déterminer la taille Oui Non Sensibilité Faible Élevée Comparer l’abondance relative Oui Oui Obtenir la séquence du transcrit Non Oui Déterminer quel brin d’ADN est transcrit Oui Oui Déterminer combien de transcrits sont fait à partir d’une séquence Oui Non LA SÉQUENCE DOIT ÊTRE EXPRIMÉE OUI OUI

13 Analyse northern Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissu
Séparer les ARN d’après leurs grosseurs sur gel d’agarose dénaturant Formaldéhyde + Formamide Hybridation avec une sonde complémentaire ARNr ARNt

14 Hybridation northern Nécessite une sonde
Hybridation = la sonde possède des séquences d’un gène La séquence est exprimée Intensité du signal d’hybridation = abondance relative Nombre de signaux d’hybridation = nombre de transcrit Possiblement nombre de gènes

15 Hybridation northern Permet de comparer la quantité relative d’un transcrit Sensibilité faible Requiert un témoin interne Gène dont l’abondance est constante sous les différentes conditions examinées Témoin pour les variations de la quantité d’ARN chargé Utilise des gènes domestiques : Gènes qui assurent les fonctions indispensables à la vie de tous les types de cellules Expression constitutive

16 La normalisation

17 Problème Un northern d’ARN isolé de différents tissus a été sondé avec le gène Fos et le gène domestique actine. Expliquer les résultats obtenus Tissus: F C R P Actine Fos

18 RT-PCR Permets d’amplifier une séquence d’ARN
Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissu Transcrire les ARN en ADNc avec transcriptase inverse Amplifier par PCR la séquence d’intérêt

19 Réaction de Transcriptase Inverse Gène Non-Spécifique
AAAAAAA ARNm AAAAAAA TTTT Transcription d’ADNc T.I. AAAAAAA TTTT Appariement d’amorce polyT Collection d’ADN complémentaire aux ARNm exprimés à un temps donné sous une condition donnée

20 Réaction de Transcriptase Inverse Gène Spécifique
AAAAAAA AAAAAAA Appariement d’une amorce gène spécifique ADN complémentaire à un ARNm d’intérêt AAAAAAA Synthèse d’ADNc T.I.

21 spécifiques à une séquence d’intérêt
RT PCR Collection d’ADNc ADNc d’ARN d’intérêt PCR avec des amorces spécifiques à une séquence d’intérêt Analyse sur gel

22 RT-PCR La séquence doit être connue pour la conception d’amorces
Produit d’amplification = Les séquences des amorces font partie d’un gène La séquence est exprimée Intensité du produit d’amplification = abondance relative La taille du produit d’amplification n’est pas égale à la taille du transcrit