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Atténuer le virus naturel de la VHD par mutagénèse dirigée et à terme l'extrapoler à l'EBHS
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Virus de la VHD 40 nm ARN simple brin 7437 bases
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Virus pathogène de la VHD Structure déterminée aux rayons X .
La capside que l’on voit est uniquement constituée d’une même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides). Le code est à l’intérieur sous la forme du brin d’ARN de 7437 b.
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VHD souche Pascal Harlaud
1/ Foie de lapin mort de la VHD envoyé par Pascal Harlaud.
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2/ Extraction de l’ARN viral broyage, centrifugation, purification
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3/ Transcription en ADN Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b)
ReverseTranscriptase-PCR Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b) Il est fragile. Nous l’avons traduit en ADN double brin, plus stable pour l’étudier et le modifier.
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4/ Lecture du code ADN a) description du code (4 lettres A, T, C, G)
à Double brin
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b) Lecture du code Vert = A Noir = G Rouge = T Bleu = C
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Code des 7437 pb de l’ADN complémentaire du virus VHD Pascal H.
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On n’a pas pu insérer le génome entier dans un plasmide,
on a donc décidé de le couper en 3 morceaux cDNA (ADN complémentaire) du virus Pascal Harlaud BstBI BamH I BamH I AvrII F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050 F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050
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Coupure par des ciseaux spécifiques (enzymes)
…G G A T C C …………………..C C T A G G ………… …C C T A G G …………………..G G A T C C ………… Exemple ADN viral Ou plasmide …G G A T C C …………………..C C T A G G ………… …C C T A G G …………………..G G A T C C ………… Ciseaux Plasmide Ouvert avec Un brin en Moins. …G C T A G G ………… …C C T A G C …………
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Colle Plasmide Ouvert avec Un brin en Moins. …G C T A G G …………
…C C T A G C ………… Fragment du génome Du virus de La VHD G A T C C …………………………………………..C G……………………………………………G G A T C Liaison à créer Association spontanée …G G A T C C …………………………………………C C T A G G …… …C C T A G G………………………………………….G G A T C C …… Création de la Liaison : (ADN ligase + ATP) …G G A T C C …………………………………………C C T A G G …… …C C T A G G………………………………………….G G A T C C ……
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Construction d'un clone 1/ Digestion du plasmide 1
Infectieux de RHDV Multi site de clonage promoteurT7 Plasmide 1 RNA Viral RHDV Litmus 28i RT-PCR 1/ Digestion du plasmide 1 par BamHI-AvrII F1 F3 AvrII BstBI BamHI BamHI 2/ ajout de F3 préparé par RT-PCR 3/ Ligation de plasmide 1 et F3 par ADN ligase. 5/ ajout de F1 préparé par RT-PCR 4/ Digestion BstBI-BamHI pF3 6/ Ligation de pF3 et F1 par ADN ligase. pF1+F3 quelques mois de travaux supplémentaires semblent nécessaires pour pouvoir insérer Le troisième fragment F2 et avoir le génome complet de la VHD dans un plasmide. F2 Nous avons déjà les 2/3 du génome complet
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Extraction du RNA viral
Purification du virus VHD Génome viral complet RNA 7437 b Extraction du RNA viral ReverseTranscriptase-PCR cDNA (ADN complémentaire) BstBI BamH I BamH I F1 = 2650 bp F2 = 2737 bp F3 = 2050 AvrII Clonage dans un plasmide Séquençage pour confirmation des séquences Mutagénèse dirigée Transcription in vitro (ADN-ARN) Transfection (cellules permissives, lapin)
