Immunoélectrophorèse présenté par : CHERADI Mohamed BELABED Abdelmounaim.

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1 Immunoélectrophorèse présenté par : CHERADI Mohamed BELABED Abdelmounaim

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3 - INTRODUCTION - HISTORIQUE - ÉLECTROPHORÈSE ET IMMUNODIFFUSION - PRINCIPE - LES TYPES -APPLICATIONS - LES AVANTAGES ET LES INCONVÉNIENTS -CONCLUSION Plan de travail :

4 Introduction : Immunoélectrophorèse a été inventé par Grabar et Williams en 1953. Après la séparation électrophorétique de protéines sériques dans un gel d' agar, les protéines sériques ont été autorisés à diffuser contre des anticorps, ce qui conduit à un motif d'arcs de précipitation dans l'agar qui représente les principaux constituants parmi les protéines sériques. Ainsi, les fractions de globuline connues à cette époque, les α -, les β - et les γ -globulines, contiennent plusieurs protéines distinctes, dont les composants principaux ont été distingués comme α 1 -antitrypsine, α 2 -macroglobuline, transferrine, C3, immunoglobuline G (IgG), IgA et IgM. - L'immunoélectrophorèse consiste en une combinaison d'une étape électrophorétique avec la précipitation ultérieure de complexes antigène-anticorps (immunoprécipités).

5 électrophorèse immunodiffusion

6 L'origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892 : Ils se sont inspirés des études de Hermann Von Helmholtz menées sur l'électro-osmose. Celui-ci constate qu'il est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe opposé à leur charge. En 1952, Pierre Grabar élabore, en collaboration avec C.A. Williams, une méthode connue sous le nom d'analyse immuno-électrophorétique Pierre Grabar (* 1898 à Kiev, 1986 ) était originaire de Russie biochimiste et immunologiste français. Historique :

7 Örjan Ouchterlony : né le 14 janvier 1914 à Stockholm et mort le 25 septembre 2004, est un immunologiste et bactériologiste suédois. On lui doit la méthode de la double diffusion en gel (immunodiffusion ou test d'Ouchterlony)

8 principe

9 Principe : Dans un premier temps, les protéines sériques sont séparées par électrophorèse. Ensuite les fractions obtenues sont étudiées avec des anticorps spécifiques des protéines sériques par la méthode de la double diffusion. 1 Electrophorèse : - Dépôt des sérums 2 µl de sérum de contrôle dans les puits marqués C et 2 µl de sérum du patient dans les puits marqués P. 1 Immunoélectrophorèse :

10 Plaque d'agarose est placée dans la cuve ( préchargée en tampon à pH=9,2), puits du côté cathode. En suit la cuve est bronché a un générateur et on applique un voltage de 90V pendant 22 min Migration :

11 Coloration : colorant amidoschwart Décoloration : acide acétique 5%

12 2- immunodiffusion : Les immuns sérums utilisés ont été préparés à partir de sérums de chèvre ou de mouton -antisérum contre sérum total humain -antisérum contre les IgG humaines (anti γ ) -antisérum contre les IgA humaines (anti α ) - antisérum contre les IgM humaines (anti µ) -antisérum contre les chaînes légères Kappa (k) -antisérum contre les chaînes légères λ

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14 Exploitation des résultats d'une immunoélectrophorèse 1- confirmation d'une gammapathie monoclonale 2- Arc contre l'antisérum IgG plus épais, plus courbé, plus proche de la rigole chez le patient: donc une augmentation d'IgG. 3- Arc contre l'antisérum IgA moins important chez le patient: plus faible concentration d'IgA probable dans son sérum. 4- Arc contre l'antisérum IgM non repérable chez le patient: sérum probablement sans IgM (ou peu). 5-6 Une partie de l'arc de précipitation contre l'antisérum anti Kappa est plus proche de la rigole et plus courbée chez le patient

15 Résultat final : L‘immunoglobuline monoclonale est une IgG de type Kappa. Il y a chez le patient une production anormalement élevée d'un même type de molécules d'IgG possédant des chaînes légères k alors que les autres types d'immunoglobulines (autres IgG, IgA, IgM) sont peu ou pas produites. Cette anomalie doit résulter d'une prolifération anormale d'un clone de lymphocytes B conduisant à un clone de plasmocytes sécréteurs de l'Ig monoclonale (maladie immunoproliférative).

16 L'électrophorèse de protéines permet d'identifier et séparer les protéines par la soumission à l'action d'un champ électrique. Les 6 fractions protéiques sont : albumine, alpha1 globuline, alpha2 globuline, beta1 et beta2 globulines, gamma globuline. Les étapes : Électrophorèse 2 Electrophorèse des protéines sériques : Gel d’agarose masque pour déposer les échantillons Applicateur

17 Plaque d'agarose est placée dans la cuve ( préchargée en tampon à pH=9,2), puits du côté cathode. En suit la cuve est bronché a un générateur et on applique un voltage de 90V pendant 22 min

18 Coloration et décoloration Placé la plaque au niveau de cymomètre intégrateur « cellomatic » Exploitation des résultats

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20 Cellomaticprofil densitométrique

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22 L'électrophorèse de protéines sériques permet de confirmer le diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire, Valeurs normales : Albumine : 55 et 65% soit 36 et 50 g /L. Alpha1 - globulines : 1 et 4% soit 1 et 5 g /L. Alpha 2 - globulines : 6 et 10% soit 4 et 8 g/l. Beta - globulines : 8 et 14% soit 5 et 12 g /L. Gamma - globulines : 12 et 20% soit 8 et 16 g /L. Variation des résultats : Par exemple: Le taux d'albumine augmente en cas de déshydratation Taux d'albumine bas en cas d ’ une malabsorption intestinale, des pathologies hépatiques (cirrhose ou cancer du foie), certaines maladies rénales, comme le syndrome néphrotique Résultat

23 1 Immunoélectrophorèse de Grabar et Williams : Les protéines migrent dans un gel d'agarose, puis on les révèle par une technique de double diffusion des antigènes et des anticorps, donnant des arcs de précipitation. Avec un antisérum total, on peut par exemple distinguer 30-40 protéines dans le sérum humain. On peut bien sûr l'utiliser également avec un antisérum spécifique. les types :

24 2 Electro-immunodiffusion double (électrosynérèse) : Cette méthode dérive en fait de la technique d'immunodiffusion double d'Ouchterlony. Elle consiste à accélérer la diffusion par un champ électrique. Les conditions électrophorétiques sont choisies de façon à ce que les antigènes et les anticorps migrent en sens inverse (ceci est possible car le pHi des Immunoglobulines est supérieur à celui de beaucoup de protéines).

25 3 Electro-immunodiffusion monodimensionnelle (Laurell) : Les protéines sont déposées sur des gels contenant l'antisérum. On se place à pH où les Ig migrent peu. Les protéines se déplacent et rencontrent les anticorps qui forment alors des précipités en forme de fusée appelés "rockets" dont la hauteur est proportionnelle à la concentration en protéine. On utilise une partie des puits pour faire un étalonnage.

26 4 Electro-immunodiffusion bidimensionnelle (Laurell) : On sépare les protéines dans une première dimension en gel d'agarose. On coule ensuite un gel contenant l'immunsérum polyspécifique, puis on réalise la seconde dimension.

27 L'immunoélectrophorèse est utilisée pour : détecter la présence ou l'absence de protéines dans le sérum dans les laboratoires cliniques. déterminer si un patient produit des quantités anormalement faibles d'un ou plusieurs isotypes d'Ig, caractéristiques de certaines maladies d'immunodéficience. déterminer les concentrations relatives d'anticorps / antigènes comparer les antigènes ou pour déterminer la pureté relative d'une préparation d'antigène. il peut également montrer si un patient surproduit certaines protéines sériques, telles que l'albumine, l'immunoglobuline ou la transferrine. Applications :

28 les avantages et les inconvénients : Une méthodes d’analyse essentiellement qualitative Permet de caractériser des composants monoclonaux dans le sérum Un délai de réponse court Nécessite une grande expertise pour sa réalisation et son interprétation les résultats manquent d'exactitude avantages inconvénients

29 L'immuno-électrophorèse est une méthode de laboratoire qui, en couplant une électrophorèse avec une solution contenant des anticorps spécifiques, va séparer les molécules composants le sérum ou l'urine en formant un précipité qui sera spécifique de chaque immunoglobuline. Conclusion :

30 merci pour votre attention