Hervé PHILIPPE BIN1001 – hiver 2006

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1 Hervé PHILIPPE BIN1001 – hiver 2006
Techniques d’étude des interactions protéine-protéines à grande échelle Hervé PHILIPPE BIN1001 – hiver 2006

2 Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?
beaucoup de matériel à disposition focus sur l’étude des fonctions cellulaires capacité des protéines à former des complexes ≈5 partenaires pour chaque protéine importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel  interactome

3 De nombreuses techniques d’étude
Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14 in vivo maintien du contexte cellulaire in vitro caractérisation détaillée des interactions (cinétique, stochiométrie …) validation des résultats in vivo

4 Co-immunoprécipitation

5 Double hybride Principe :
utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure domaine d’activation domaine de liaison à l’ADN fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent

6 Fusion protéines et modules du facteur de transcription
Double hybride Système rapporteur DA : domaine d’activation DL : domaine de liaison à l’ADN DA TF DL colonies de levures pas d’expression expression du gène mARN DA DL prot 1 prot 2 prot 3 Fusion protéines et modules du facteur de transcription mARN Expression du système

7 Double hybride Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246.
Avantages : expérience facile à mettre en place Inconvénients : analyse qualitative faux positifs si les interactions préexistent chez la levure faux négatifs : problème d’expression des protéines cibles chez la levure non applicable aux protéines membranaires (30% du protéome) Application : identification des interactions criblage de banque de protéines

8 Interactome chez C. elegans
Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543

9 PCA : protein fragment complementation assay
Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91: Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7 Principe : rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente) fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à tester mesure de la reconstitution du rapporteur si les protéines testées interagissent

10 PCA : protein fragment complementation assay
Avantages : applicable pour les protéines membranaires réponse très rapide Inconvénients : décalage temporel de la réponse au signal d’expression nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique Application : identification des interactions étude des réseaux d’interaction

11 FRET (fluorescence resonance energy transfer)
L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846 R0 10-70 Å excitation nm émission accepteur 475 nm 525 nm donneur 475 525 Principe : excitation d’un fluorophore donneur par un photon émission fluorescence par le donneur excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche mesure du rapport de fluorescence

12 FRET (fluorescence resonance energy transfer)
Avantages : étude dynamique en temps réel applicable in vivo dans le système cellulaire originel peut être couplé à un signal biologique applicable dans tous les compartiments cellulaires Inconvénients : création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions nécessite la surexpression des protéines testées Application : signification biologique des interactions localisation cellulaire par couplage avec des techniques de microscopie

13 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification
Principe : 1. peptide de fixation à la calmoduline domaines de fixation de la ProtA aux IgG site de clivage à la TEV protéase 2. constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants clivage du tag par la protéase fixation du complexe via le peptide de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase élution du complexe et analyses subséquentes 3. 4. 5. Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229

14 Spectrométrie de masse
Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21 Inconvénients : nécessite la purification des complexes méthode compliquée et coûteuse Application : identification des protéines présentes dans un complexe

15 TAP-Tag : Tandem Affinity Purification
Avantages : seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe taux d’expression biologique des protéines identification de complexes avec plus de 2 protéines Inconvénients : seules les interactions très stables peuvent être détectées Application : identification des complexes protéiques