Clonage Moléculaire.

Présentation au sujet: "Clonage Moléculaire."— Transcription de la présentation:

1 Clonage Moléculaire

2 Définitions Clonage : Sous-clonage: Plasmide recombinant:
Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale (Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN Sous-clonage: Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie de ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur Plasmide recombinant: Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit Organisme recombinant Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduit

3 Pourquoi cloner? Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique d’ADN 3

4 Étape 1- Séparer Deux approches: Fragmenter/digérer l’ADN génomique
Génère un très grand nombre de fragments Peut-être difficile de retrouver le fragment d’intérêt Amplification par PCR Beaucoup moins de fragments Beaucoup plus facile de retrouver la séquence d’intérêt

5 Cloner Enzyme de restriction Enzyme de restriction
Générer des extrémités compatibles Ligature d’ADN Vecteur approprié Fragment d’intérêt Ligature Intermoléculaire Recombinant Ligature Intramoléculaire Non-Recombinant Transformation Cellules Hôte Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante 1 plasmide/1 cellule

6 Amplification des Plasmides Recombinants
Duplication de plasmide 1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert Croissance bactérienne

7 Criblage et Identification de Clones Recombinants Plasmidiques
Cartographie de restriction Hybridation PCR

8 Expression Pourquoi? Produire la protéine dans un système hétérologue
Produire la protéine en grande quantité Purifier la protéine Étudier l’activité de la protéine

9 Amplification, Mutagenèse, Clonage & Expression de LacZ– Projet II
Partie I Amplification & mutagenèse par PCR du gène LacZ Partie II Clonage de LacZ dans pUC19 Partie III Esai enzymatique des protéines recombinantes

10 Purification & Digestion de l’ Amplicon Mel 1
Purification par QiaQuick Permet de retirer le tampon, sels, etc. Permet de retirer les amorces Permet de retirer l’enzyme Digestion Sites de restriction BamHI et EcoRI ont été ajoutés à la séquence de l’amplicon Absent dans la séquence de Mel 1 Présent dans le site de clonage multiple du vecteur d’expression (pRS424) Permet le clonage dirigé