Technologie de l’ADN recombinant

Présentation au sujet: "Technologie de l’ADN recombinant"— Transcription de la présentation:

1 Technologie de l’ADN recombinant
Gaëlle DIRIBARNE, 2008 1

2 Principe VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Exemple : gène associé à une maladie Amplification de cet ADN, expression des protéines correspondantes... Obtention d'un ADN Recombinant

3 Définitions L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un organisme donneur et celui d’un vecteur (qui peut être d'une espèce totalement différente). Génie Génétique ou technologie de l’ADN recombinant : ensemble des techniques de construction d’un ADN recombinant et ses utilisations. Les cellules modifiées (ayant intégré un ADN recombinant) peuvent exprimer la protéine recombinante (par exemple une protéine d’une espèce différente, une protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette…)). Le clonage désigne plusieurs choses : - Une multiplication à l'identique (conservation parfaite de l'information génétique) : à l’échelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à l’échelle de l’organisme entier (clonage reproductif). - L’amplification d’un fragment d’ADN par des micro-organismes après son insertion dans un vecteur

4 Plan A/ Les principales techniques du génie génétique
B/ La diversité des techniques du génie génétique C/ Les applications de la technologie de l’ADN recombinant

5 A/ Les principales techniques du génie génétique
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6 Principe de la technologie de l’ADN recombinant
I) Obtention de l’ADN recombinant VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant l’ADN recombinant II) Utilisation de Expression et purification des protéines correspondantes, étude du niveau d’expression et des fonctions des protéines...

7 I) Obtention de l’ADN recombinant
1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt 3) Présentation d’un vecteur 2) Amplification du fragment d’ADN du donneur 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur : Digestion - Ligation Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant 5) Amplification de l’ADN recombinant obtenu 6) Vérification de la construction

8 ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt
I) Obtention de l’ADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt 1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur

9 1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
L'ADN de l'organisme donneur peut être : - de l'ADN génomique (extrait à partir d'une culture cellulaire...) - de l’ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription réverse sur des ARN messagers (L’ADNc comporte une information sur les régions 5' et 3' non traduites, et ne contient pas d'introns)

10 1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur
AAAAAA 3’ ARNm avec queue polyA ’ TTTTT 1) Hybridation avec un oligonucléotide complémentaire de la queue polyA 2) Élongation de l'amorce par la transcriptase réverse Principe de la transcription réverse => Obtention d'un brin d’ADN complémentaire Pour obtenir le deuxième brin d’ADNc, une PCR est réalisée sur l’ADN obtenu avec une ADN polymérase (voir principe diapo 12). L’ARN peut être éliminé par un traitement la RNase. On peut obtenir une banque d'ADNc : clonage de tous les ADNc (cela dépend des ARNm exprimés par une cellule à un moment donné dans des conditions données) On peut aussi cloner un ADNc spécifique en choisissant une amorce à cheval sur la queue polyA et le 3' du transcrit

11 ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt
I) Obtention de l’ADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt 1) Origine de l’ADN de l’organisme donneur 2) Amplification du fragment d’ADN d’intérêt

12 2) Amplification du fragment d’ADN d'intérêt : la PCR
Amplification du fragment d'ADN d'intérêt (gène entier ou tronqué) par PCR : Polymerase Chain Reaction La PCR est une réaction de polymérisation en chaîne à partir d'amorces spécifiques de l'ADN d'intérêt, grâce à l'action d'une enzyme, l’ADN polymérase dans un milieu contenant des nucléotides

13 2) Amplification du fragment d’ADN d'intérêt : la PCR
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' Séquence à amplifier

14 2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 95 Température (°C) 72 1ère étape : dénaturation de l'ADN à 95°C (séparation des brins complémentaires) Tm Temps

15 2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 3' C G C 5' Amorce Amorce 5’ G T C 3' 95 2ème étape : hybridation des amorces (séquence de nucléotides complémentaires de l’extrêmité de la région à amplifier) à une température Tm (spécifique de l'amorce) (en général amorces de nucléotides) Température (°C) 72 Tm Temps

16 2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' C G C 5' G T C 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' A T A G C A G C C T T A G G T A G G A A T C C A T G C G T A C G 5' 3ème étape : élongation (synthèse du brin complémentaire à partir des amorces grâce à l’enzyme ADN polymérase et aux nucléotides présents dans le milieu réactionnel). Fonctionnement de l’enzyme à 72°C. 95 Température (°C) 72 Fin du premier cycle de PCR : aucune molécule obtenue ne correspond au produit désiré (souligné). Un nouveau cycle de PCR (dénaturation-hybridation-élongation) commence. Tm Temps

17 2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Produits du 1er cycle de PCR : Brin 1 5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' C G C 5' G T C 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' G G A A T C C A T G C G T A C G 3’ 3'A T A G C A G C C T T A G G T A Brin 2 Brin 3 Brin 4 Produits du 2ème cycle de PCR : (les amorces sont en magenta) Produit PCR formé à partir du brin 1 5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5' 5'G T C G G A A T C C A T G C G 3' 5’G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'C A G C C T T A G G T A C G C 5' 5'G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' Produit PCR formé à partir du brin 2 Produit PCR formé à partir du brin 3 Produit PCR formé à partir du brin 4

18 2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5' G T C G G A A T C C A T G C G 3' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'C A G C C T T A G G T A C G C 5' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' 5' 5' 1er cycle 2ème cycle 95 Molécules obtenues à la fin du second cycle de PCR. Aucune ne représente le produit d'intérêt (souligné). Température (°C) 72 Tm Temps

19 2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Molécules d’ADN obtenues à la fin du 3ème cycle de PCR : Fin du troisième cycle : deux produits PCR attendus apparaissent. Ces produits vont ensuite se multiplier de façon exponentielle par rapport aux produits non souhaités. T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 19

20 2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' Les deux molécules d’intérêt obtenues au 3ème cycle donnent chacune deux molécules d’ADN d’intérêt au 4ème cycle. 4 fragments simple brin des autres molécules pourront donner un produit PCR souhaité au 4ème cycle. 5' 5' 5' 5' 5' 5' Quatrième cycle de PCR : 8 fragments d'ADN d'intérêt Cinquième cycle de PCR : 22 fragments d'intérêt 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 20

21 2) Amplification du fragment d’ADN : la PCR
Répétition des 3 étapes : dénaturation-hybridation- élongation (la machine à PCR fait des cycles de température) => Amplification du fragment d'intérêt de façon exponentielle à partir du troisième cycle L’enzyme ADN polymérase ne doit pas être dénaturée à 95°C : utilisation de l'ADN polymérase de bactéries thermophiles (par exemple la Taq polymérase provient de Thermophilus aquaticus, microorganisme vivant près des sources d’eaux chaudes (50 à 80°C) ; la Pfu polymérase provient de Pyrococcus furiosus) Différentes enzymes peuvent être utilisées selon le degré de fidélité souhaité pour l'amplification du fragment (la Pfu est beaucoup plus fidèle mais plus lente pour l'amplification par exemple)

22 I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Le clonage repose sur l'insertion d'un fragment d'ADN exogène dans un vecteur, ce qui permet ensuite d'exprimer l'ADN dans des cellules 3) Présentation d’un vecteur

23 3) Présentation d’un vecteur de clonage
Grande diversité des vecteurs : (détaillée en B) Cosmides Bactériophages Chromosomes artificiels de levure (YAC) et de bactérie (BAC) Plasmides : très souvent utilisés, réplication dans les bactéries (exemple choisi) Les vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une origine naturelle (plasmides, bactériophages) mais ont été largement modifiés

24 3) Présentation d’un vecteur : Propriétés du vecteur
Capacité de réplication autonome dans une cellule hôte donnée Possession d’un site de clonage multiple pour l'insertion du fragment d'ADN (correspond à différents sites uniques de restriction = des sites où le vecteur peut être ouvert, voir 4)) Insertion d'un fragment d'ADN plus ou moins grand bien supportée Présence fréquente d’un marqueur de sélection (gène de résistance à un antibiotique, marqueur de sélection métabolique)

25 3) Présentation d’un vecteur : Exemple du plasmide
Promoteur (pour pouvoir exprimer la protéine d'intérêt il faut cloner la séquence d'ADN en phase avec le promoteur (cf. cadre de lecture de la traduction) Site de clonage multiple : nombreux sites de restriction (voir 4)) uniques permettant l'insertion de l'ADN après le promoteur a) Vecteur Plasmide : petite molécule extrachromosomique, d'ADN double brin circulaire, de 3 à 10 kilobases. Capable de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien et pouvant être transféré d'une cellule à une autre. Origine de réplication dans la bactérie Marqueur de sélection : résistance contre l'antibiotique kanamycine

26 I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur :

27 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Définition des enzymes de restriction Une enzyme de restriction est une protéine capable de couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. C'est une endonucléase (coupure à l'intérieur du brin d'ADN au niveau des liaisons phosphoesters). Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement connues, dont un grand nombre se retrouve naturellement chez la bactérie. En effet, les enzymes de restriction peuvent couper (et ainsi conduire à la destruction) de l'ADN étranger (notamment des virus). Cela limite les infections virales chez les bactéries, d'où le terme de restriction. L'ADN bactérien lui-même est protégé de la coupure par des modifications du type méthylation.

28 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Exemple d’une enzyme de restriction Exemple : site de restriction de l'enzyme EcoRI (provenant de la bactérie Escherichia coli) Rq : Certaines enzymes donnent des bouts francs après coupure. Exemple : SmaI : CCC GGG GGG CCC 5' GAATTC CTTAAG 3' 3' 5' 5' G AATTC CTTAA G 3' Coupure par EcoRI Formation d'extrémités dites cohésives, ou bouts collants Rq : Certains sites de restriction sont des séquences palindromiques 28

29 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Principe
Digestion 1 heure dans le tampon adapté à l'enzyme (cf. quantité de sels...) à la température optimale de l'enzyme Vecteur (plasmide) Digestion par les enzymes 1 et 2 Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2. Site de restriction Enzyme 2 Site de restriction Enzyme1 Si l’on digère le fragment d’ADN par les deux mêmes enzymes 1 et 2, donnant des bouts collants, on obtient des extrémités cohésives complémentaires avec celles du vecteur. Ceci permet l’insertion du fragment d’ADN dans le vecteur. TTAA AATT Vecteur Fragment à cloner Vecteur digéré + Petit fragment d’ADN dégagé lors de l’ouverture du plasmide

30 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Digestion du fragment d’ADN Le fragment d’ADN d’intérêt ne contient pas forcément les bons sites de restriction. Comment peut-on les ajouter aux extrêmités de l’ADN à cloner ? Cela se fait par PCR avec des amorces spéciales : 5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' C G C G T C 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' 5' ADN d'intérêt Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 1 Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 2

31 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Digestion du fragment d’ADN Voici l'ADN obtenu après PCR, avec les sites de restriction à ses extrémités. Il pourra être utilisé pour le clonage. 5' G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C 3' 3' 5' ADN d'intérêt Séquence du site de restriction de l'enzyme 1 Séquence du site de restriction de l'enzyme 2

32 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Digestion du vecteur Digestion par les enzymes 1 et 2 Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2. Vecteur (plasmide) Site de restriction Enzyme 2 Site de restriction Enzyme1 Le fragment d’ADN doit être cloné dans le vecteur digéré. Le petit fragment dégagé peut se réinsérer dans le vecteur digéré à la place du fragment d’ADN à cloner. Il est donc nécessaire de séparer les deux produits de la digestion du vecteur et de purifier le vecteur digéré pour la suite du clonage. Vecteur digéré + Petit fragment d’ADN dégagé lors de l’ouverture du plasmide

33 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré L’électrophorèse est une méthode de séparation des particules chargées électriquement par migration différentielle sous l’action d’un champ électrique. Elle s’applique aux : protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques, nucléotides La migration dépend de la charge et de la géométrie des particules L’électrophorèse peut se faire en veine liquide ou sur un support homogène, poreux et relativement inerte (papier, gels…)

34 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose Les fragments de restriction sont visualisés sur gel d'agarose par électrophorèse : ci-contre le dispositif utilisé Dépôt des échantillons dans les puits du gel Gel d'agarose + Générateur électrique - champ électrique Principe : migration des fragments d'ADN dans un champ électrique, séparation en fontion de leur taille Solution d'électrolyte qui recouvre le gel (assure la conduction électrique)

35 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose Principe de l’électrophorèse : Les fragments d'ADN migrent de façon inversement proportionnelle à leur taille : les plus gros fragments migrent peu tandis que les petits fragments migrent beaucoup Fragments de restriction : vecteur digéré et bout dégagé par la restriction Dépôt dans le puits du gel - Migration des fragments d'ADN entre les particules de gel selon le gradient électrique (les acides nucléiques sont globalement négatifs, déplacement vers le pôle +) + Particule de gel

36 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur a) Digestion du fragment d’ADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel d’agarose Marqueur de poids moléculaire : fragments de taille connue (obtenus par exemple après digestion enzymatique de l'ADN du bactériophage Lambda) => cela permet de déterminer la taille des bandes d'intérêt par comparaison au marqueur Révélation du gel par incubation avec un intercalant d'ADN (fluorescent) 1 2 1 : bande du vecteur digéré 2 : petit fragment extrait du vecteur lors de la digestion Il est possible de récupérer la bande 1 : on découpe la bande sur le gel, on extrait l'ADN de l'agarose et on le purifie sur une colonne (fixation de l'ADN sur la colonne, lavage, puis élution de l'ADN purifié) => on récupère ainsi l'ADN du vecteur digéré, utilisé pour le clonage. Cette purification sur gel permet aussi d’éliminer en partie les traces de vecteur non digéré. Si le fragment d’ADN dégagé à éliminer est très petit, une purification sur colonne peut être suffisante.

37 + 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
b) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur Fragment d‘ADN à cloner Vecteur (plasmide) 5' 3' 3' 5' Site de restriction Enzyme 2 Site de restriction Enzyme1 Digestion du vecteur et du fragment d’ADN à cloner par les enzymes 1 et 2 5' 3' Vecteur digéré 3' 5' => Création d'extrémités collantes complémentaires. Insertion du fragment d’ADN dans le vecteur ouvert purifié, hybridation au niveau des extrêmités complémentaires. Il reste à lier ces deux morceaux d’ADN de façon covalente. + Petit fragment d’ADN dégagé lors de l’ouverture du plasmide

38 4) Insertion de l’ADN dans le vecteur
b) Ligation du fragment d’ADN dans le vecteur 5' P 3' 0H P 5' OH 3' -P-0- -0-P- Ligase La ligase est une enzyme capable de former des liaisons covalentes (formation de liaisons phosphoester) entre deux molécules d'ADN (au niveau d'une zone d'hybridation des molécules d'ADN) Intérêt d'utiliser deux enzymes différentes lors de la digestion : insertion orientée de l’ADN à cloner dans le vecteur limitation de la religation du vecteur sur lui-même Fragment d'ADN d’intérêt inséré dans le vecteur Après ligation, on obtient un plasmide recombiné Liaison phosphoester

39 I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu

40 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Transformation des bactéries
2) Choc thermique à 42°C : les plasmides vont pénétrer dans les bactéries 3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, croissance 1h à 37°C (cela permet l'expression des protéines de résistance aux antibiotiques pour la sélection ultérieure) 4) Étalement sur boîte (pour la sélection) 1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace (les bactéries compétentes ont été traitées pour faciliter l'entrée d'ADN : leur paroi a été fragilisée par un traitement au chlorure de calcium) (utilisation de Escherichia coli en général : utilisation facile, croissance rapide) Une fois les bactéries au contact de la solution de plasmides à intégrer, la mb plasmique est momentanément perméabilisée (formation de micropores) par choc thermique ou choc électrique (électroporation)

41 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Sélection des bactéries transformées
Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné) Étalement des bactéries sur une boîte contenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules les bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gène de résistance contre l'antibiotique Colonie de bactéries transformées Chaque colonie = ensemble de bactéries identiques provenant de la division d'une bactérie. Maintien du plasmide // pression de sélection due à l'antibiotique Mélange de bactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées

42 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné
Ensemencement d’une colonie de bactéries transformées dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C => Multiplication des bactéries et donc amplification du nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide) Il faut ensuite récupérer le plasmide

43 5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné
Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique. L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des colonnes de purification d’ADN.

44 I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt Les bactéries poussant sur le milieu+antibiotique possèdent un plasmide avec le gène de résistance à l’antibiotique. Mais ce plasmide contient-il l’insert cloné ? Il peut y avoir religation du vecteur sur lui-même. Nécessité d’un crible pour trouver les clones positifs ayant intégré l’ADN à cloner. Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant amplifié 6 ) Vérification de la construction

45 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui-même (2) => il faut distinguer ces deux populations 2 1 PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose

46 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui-même (2) => il faut distinguer ces deux populations (1) (2) PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose : Résultats du gel d’agarose : Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2), mais un produit visible pour le plasmide recombiné (1)

47 6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction
Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur : 2 1 (ex : MscI)

48 6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction
(1) (2) Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur puis Analyse des produits de restriction sur gel d'agarose On obtient des cartes de restriction différentes : une seule coupure et donc une seule bande pour le vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes pour le plasmide recombiné (1)

49 ADN de séquence inconnue, à séquencer
6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Choix d'une amorce Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase La synthèse du brin complémentaire est faite en présence de nucléotides désoxyribose, Désoxyribose : formation possible d'une liaison phosphoester (élongation de la chaîne synthétisée) P nucléotide 5’-P-polynucléotide ADN de séquence inconnue, à séquencer ADN de séquence connue Didésoxyribose : formation d'une liaison phosphoester impossible, blocage de l'élongation de la chaîne synthétisée P nucléotide Et de nucléotides didésoxyribose. 5’-P-polynucléotide

50 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du didésoxynucléotide intégré : ADN à séquencer 3' A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A 5' amorce ddT T-A-ddT T-A-T-C-G-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 5' Brins formés en présence de didésoxy-thymine (ddT) dans le milieu réactionnel

51 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou fluorescence. Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif (détection d'une différence d'un nucléotide) 6 5' ddT T-A-ddT 2 T-A-T-C-G-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-ddT 4 T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6 5 5' 4 5' 3 5' 5' 2 5' 1

52 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger ADN à séquencer : 3' A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A Lecture du brin complémentaire : ddT ddA ddG ddC 5' T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T Une réaction de synthèse différente pour chacun des didésoxynucléotides, analyse sur gel pour chaque réaction, lecture du brin complémentaire (en partant des plus petits fragments vers les plus gros) 4 3 2 1

53 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Automatisation du séquençage
ADN à séquencer : 3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T Lecture du brin complémentaire : 5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A Automatisation des résultats de séquençage : les didésoxynucléotides sont marqués avec des fluorescences différentes, cela permet de faire une seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur détecte la fluorescence et repère la taille des fragments d'ADN. On obtient des courbes de fluorescences qui sont interprétées en terme de nucléotides avec un indice de confiance (ici barre verte : confiance maximum)

54 Obtention d'un ADN Recombinant amplifié
II) Utilisation de l’ADN recombinant Obtention d'un ADN Recombinant amplifié Utilisation de l’ADN recombinant, notamment pour comprendre le fonctionnement des gènes Quelques exemples : - Production et purification de la protéine étudiée en grandes quantités (pour des analyses structurales, recherche de protéines associées, de modifications post-traductionnelles…) - Etude de l’expression des gènes, quantitative et qualitative ; temporellement et spatialement - Etude de la fonction des gènes (fabrication de protéines mutantes…) 1) Production de protéines recombinantes

55 1) Production de protéines recombinantes a) Protocole : contraintes et solutions
Expression des protéines dans des bactéries E. coli dépourvues de protéases (préservation de la protéine produite) Les cellules sont cultivées en grandes quantités (dans des fermenteurs pour la production de protéines à l'échelle industrielle) Problème : avec un fort taux de croissance et une synthèse très importante des protéines recombinantes, les cellules meurent rapidement, ce qui limite alors l'expression des protéines recombinantes Pour résoudre ce problème : découplage entre une phase de croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du gène de la protéine d'intérêt) et une phase d'expression (transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine)

56 1) Production de protéines recombinantes a) Protocole : contraintes et solutions
Une cellule hôte procaryote présente certaines contraintes : nécessité d'un promoteur procaryote pour que la bactérie puisse transcrire le gène d'intérêt (il faut donc travailler avec un vecteur adéquat) la bactérie ne fait pas d'épissage. Ce problème est évité par une construction à partir d'un ADNc (comme il est obtenu à partir d'un ARNm mature, il est dépourvu d'introns) Cependant, culture facile et croissance rapide des bactéries (contrairement aux cellules eucaryotes comme levures et ovules)

57 1) Production de protéines recombinantes a) Protocole
0) Transformation de bactéries compétentes par le plasmide d'intérêt, culture à partir des colonies obtenues 2) Induction de l'expression des protéines par activation de la trancription du gène de la protéine 1) Culture des bactéries dans du milieu nutritif + antibiotique nécessaire à la sélection => à 37°C, jusqu'à une densité optique de 0,6 environ (cela correspond à la phase exponentielle, les bactéries sont en pleine croissance) 3) Récupération des protéines

58 1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel
La transcription du gène codant pour la protéine d’intérêt est contrôlée à l’aide de promoteurs inductibles : Promoteurs thermosensibles (changement de l’expression suivant la température) Promoteur de l’opéron lactose

59 1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel
Présentation de l’opéron lactose : Gène régulateur Sites de contrôle Gènes de structure P LacI T CAP P O LacZ LacY LacA T Répresseur de l'opéron lactose : en se fixant sur l’opérateur, il bloque la transcription de LacZ, LacY et LacA Bétagalactosidase (clivage du lactose en glucose + galactose) Perméase (pompage du lactose dans la cellule) Transacétylase P : promoteur T : terminateur O : opérateur CAP : site de fixation de CAP (récepteur de l'AMPcyclique), activateur de la transcription

60 1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel
Fonctionnement de l'opéron lactose dans la bactérie : 1) Absence de lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Absence de transcription P LacI T CAP O Gènes de structure 2) Absence de lactose, peu de glucose dans le milieu : => Absence de transcription 4) Lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Transcription basale P LacI T CAP O Gènes de structure 3) Lactose, peu de glucose dans le milieu : => Transcription active Analogue de lactose Polymérase

61 1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel
Modification de l'opéron lactose pour les clonages : Pour les clonages,remplacement du gène LacZ par la séquence du gène de la protéine d'intérêt. Utilisation d'IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), un analogue de lactose : l'IPTG se lie avec le répresseur, l'empêchant alors de se fixer sur l'opérateur. Cela permet l'activation de la transcription P LacI T CAP P O Gène de la protéine d'intérêt T LacI IPTG Transcription active

62 1) Production de protéines recombinantes c) Extraction des protéines
Les protéines sont dans le cytoplasme des bactéries, qui ont aussi une paroi. Il est donc nécessaire de lyser les bactéries pour récupérer les protéines. Etape de sonication (destruction mécanique par des ultrasons) et ajout d’un détergent (lyse chimique)

63 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS Le gel de polyacrylamide est une matrice inerte formant beaucoup de liaisons croisées à travers lesquelles migrent les protéines. Il joue le rôle d'un tamis moléculaire. La taille des pores peut être ajustée suivant la taille des protéines que l'on souhaite visualiser. Prélèvement d’un échantillon de l’extrait bactérien, supposé contenir nos protéines Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant

64 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS Le tampon de charge (Laemmli) contient notamment : - du glycérol qui augmente la densité de l’échantillon et facilite son dépôt dans les puits du gel - un colorant, qui facilite le suivi de la migration des échantillons sur gel ET SURTOUT : - des agents réducteurs : destruction des ponts disulfures des protéines, - un détergent anionique SDS (sodium dodécylsulfate) : fixation sur les régions hydrophobes de la protéine, cela provoque alors son dépliement => la protéine est soluble dans la solution de détergent Prélèvement d’un échantillon de l’extrait bactérien, supposé contenir nos protéines Dénaturation des protéines par mélange avec du tampon de charge, et chauffage 5min à 95°C Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant

65 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS La charge intrinsèque de la protéine est masquée par les charges négatives du SDS. Les protéines vont donc migrer vers le pôle positif lors de l'application d'une tension. Les grandes protéines, quoi que plus chargées négativement migrent moins loin car elles sont davantage retenues par le maillage du gel. Les protéines sont alors fractionnées selon leur masse moléculaire. Prélèvement d’un échantillon de l’extrait bactérien, supposé contenir nos protéines Dénaturation des protéines Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant Rq : Cette méthode est très puissante : elle permet d'analyser des protéines insolubles dans l'eau, protéines membranaires, protéines de gros agrégats... Elle apporte des informations sur la composition des sous-unités d'un complexe protéique.

66 Migration des protéines selon leur taille
1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS Gel d’acrylamide dénaturant Electrophorèse en conditions dénaturantes (destruction des structures tertiaires et quaternaires), migration des protéines inversement proportionnelle à leur masse Solution d'électrolyte Dépôt des échantillons dans les puits du gel - Plus lourd Migration des protéines selon leur taille Plus léger Générateur électrique + Solution d'électrolyte

67 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Coloration ou transfert sur membrane Toutes les protéines fortement exprimées peuvent être détectées par leur coloration dans le gel (au bleu de Coomassie ou avec du nitrate d'argent pour des protéines moins concentrées). C’est une détection globale de toutes les protéines fortement exprimées. Des protéines en plus faibles quantités peuvent être détectées par Western Blot après transfert sur membrane (ex : membrane de nitrocellulose). Cette détection est spécifique.

68 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Transfert sur membrane Principe du transfert sur membrane : - + Générateur électrique Papiers buvard imbibés de tampon Membrane Gel Les protéines se déplacent selon le champ électrique, elles passent du gel à la membrane. Le transfert se déroule pendant une à 2 heures. Le même principe est utilisé pour le transfert des acides nucléiques (qui peuvent aussi être transférés en une nuit par capillarité, en absence de champ électrique)

69 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Détection des protéines par Western blot Détection des protéines sur la membrane par WESTERN BLOT : reconnaissance spécifique de la protéine qui nous intéresse à l'aide d'un anticorps dirigé contre cette protéine. 1) Saturation des sites non spécifiques par incubation avec du lait (les protéines du lait vont se fixer sur la membrane, ce qui limite la liaison des anticorps sur des sites non spécifiques) 2) Incubation avec l'anticorps primaire spécifique de la protéine : Reconnaissance de la protéine par l'anticorps Anticorps primaire spécifique de la protéine Membrane Protéine d'intérêt

70 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Détection des protéines par Western blot 3) Lavages de la membrane (les anticorps non fixés sont éliminés) 4) Incubation avec l'anticorps secondaire, qui reconnaît l'anticorps primaire. Une enzyme est fixée sur l'anticorps secondaire Anticorps secondaire spécifique du premier anticorps Enzyme fixée sur l'anticorps Anticorps primaire spécifique de la protéine Membrane Protéine d'intérêt

71 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de l’expression des protéines : Détection des protéines par Western blot 6) Révélation du Western Blot : le substrat de l'enzyme est ajouté. La réaction enzymatique transforme ce substrat en un produit luminescent Substrat de l'enzyme La réaction enzymatique donne un produit luminescent 5) Lavages de la membrane (les anticorps non fixés sont éliminés) Membrane Protéine d'intérêt Exemple d'image obtenue sur film photosensible Signal de notre protéine La lumière émise peut être détectée sur un film photosensible, ou par une caméra Marqueur de poids moléculaire (kDa) 40 60

72 1) Production de protéines recombinantes e) Détection des acides nucléiques
Les électrophorèses sur gel d'acrylamide sont aussi utilisées pour la séparation des acides nucléiques de petite taille ; pour des fragments plus grands, un gel d’agarose est utilisé. La révélation se fait après transfert sur membrane : Pour les ADN : on révèle les ADN sur la membrane à l'aide de sondes ADN complémentaires marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de SOUTHERN BLOT. Le Southern Blot a été inventé par Edward M. Southern en Cette méthode a ensuite été appliquée à d'autres molécules que les ADN (Western Blot pour les protéines et Northern Blot pour les ARN) Pour les ARN : on révèle les ARN sur la membrane à l'aide de sondes ADN complémentaires de la séquence de l'ARN étudié, marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de NORTHERN BLOT.

73 1) Production de protéines recombinantes e) Détection des acides nucléiques
Remarque : Comment marquer une molécule d’ADN pour obtenir une sonde ? 5’ 3’ Fragment d’ADN de restriction purifié 3’ 5’ Dénaturation et hybridation avec un mélange d’oligonucléotides de 6 nucléotides 5’ 3’ PCR avec ADN polymérase en présence de nucléotides marqués : soit radioativement, soit chimiquement (détection avec un anticorps spécifique du groupement chimique) 5’ 3’ Obtention de petits ADN marqués, complémentaires de différentes zones sur les 2 brins de l’ADN considéré

74 2) Purification des protéines
II) Utilisation de l’ADN recombinant Les protéines recombinantes sont exprimées en grandes quantités, mais sont mélangées avec les protéines bactériennes. Il est donc nécessaire de purifier la protéine d’intérêt. 2) Purification des protéines 74

75 2) Purification des protéines a) Chromatographie
Une technique de séparation des protéines est la chromatographie. Elle nécessite une phase stationnaire et une phase mobile, la séparation se fait en fonction de l’affinité des protéines pour chacune des phases. Exemple d’une chromatographie sur colonne : 1) Solutés (mélange) 2) Passage continu d’une phase mobile (solvant) 3) Séparation des composants de l’échantillon suivant leur affinité pour la phase mobile et la phase stationnaire Phase stationnaire

76 2) Purification des protéines a) Chromatographie
+ - Flux de solvant Molécules chargées négativement retenues sur les billes chargées positivement - Chromatographie de partage (en phase inverse) : phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire. Séparation selon le degré de polarité des composés. - Chromatographie d’échange d’ions : phase stationnaire chargée positivement ou négativement. Séparation suivant la charge des composés. - Chromatographie d’exclusion : support poreux. Séparation en fonction de la taille : les grosses molécules sortent très vite de la colonne tandis que les plus petites, qui peuvent traverser les pores sont retardées et sortent plus tard. - Chromatographie d’affinité : séparation selon des propriétés de forme. C’est la technique la plus puissante car elle repose sur des interactions spécifiques. Flux de solvant Petites molécules retardées par la traversée des billes poreuses ; grosses molécules non retardées

77 2) Purification des protéines b) Chromatographie d’affinité
- Immunopurification : utilisation de l’interaction Anticorps/Ligand Cette technique est spécifique de la protéine étudiée. Des anticorps reconnaissant la protéine sont fixés à des billes (phase stationnaire). Dépôt de l’extrait cellulaire sur la colonne (phase d’accrochage sur les anticorps) Protéine d’intérêt Après lavages (élimination des molécules interagissant de façon peu spécifique), les protéines d’intérêt peuvent être éluées (par exemple avec un peptide compétiteur). anticorps billes

78 2) Purification des protéines b) Chromatographie d’affinité
L’immunopurification permet de purifier une protéine spécifique, mais il faut disposer d’un anticorps suffisamment efficace et spécifique. De plus, on n’a pas toujours de systèmes d’élution efficaces. Etiquette (molécule de fusion, par exemple peptide de fusion) Protéine d'intérêt Protéine d'intérêt fusionnée à une étiquette On utilise aussi d’autres systèmes de chromatographie d’affinité reposant sur des interactions ligand/récepteur du ligand et l’utilisation d’une protéine recombinante fusionnée à une étiquette.

79 2) Purification des protéines b) Chromatographie d’affinité
Des groupements (récepteurs du ligand) fixés sur la colonne interagissent avec le peptide de fusion. Toutes les autres protéines, non retenues sur la colonne sont éliminées. Dépôt de l'extrait cellulaire sur la colonne Rétention de la protéine d'intérêt Protéine d'intérêt Peptide de fusion Protéine d'intérêt avec une étiquette Protéines bactériennes Protéines non retenues sur la colonne Lavages pour éliminer les éventuels contaminants

80 2) Purification des protéines b) Chromatographie d’affinité
Ajout d'un agent permettant l'élution (un compétiteur) Après élution on obtient les protéines d'intérêt fusionnées. Un clivage peut être effectué entre la protéine d'intérêt et le peptide de fusion. Un nouveau passage sur colonne d'affinité permet de retenir les peptides de fusion et de récupérer les protéines purifiées Clivage spécifique Rétention de la protéine de fusion sur la colonne Protéine d'intérêt purifiée Protéines d'intérêt éluées

81 Conclusion : Utilisation des protéines recombinantes :
Avec de grandes quantités de protéine purifiée, possibilité d’analyser la structure 3D par diffraction des rayons X ; possibilité d’analyser les modifications post-traductionnelles de la protéine au spectromètre de masse Possibilité de co-purifier des protéines associées à la protéine étudiée si les lavages ne sont pas trop stringents Billes Anticorps Protéine d’intérêt Protéines associées Séparation des protéines sur gel ; études par Western blot pour des protéines connues ou par spectromètre de masse pour des molécules inconnues La protéine est digérée pour obtenir un ensemble de peptides. Dans le spectromètre de masse, les peptides sont fragmentés, et la masse des fragments obtenus est mesurée. L’ensemble des masses des différents fragments est caractéristique d’une molécule donnée. Cette technique permet d’identifier des molécules, mais aussi de détecter des modifications sur une protéine connue

82 II) Utilisation de l’ADN recombinant
Différents types cellulaires sont caractérisés par l’expression de protéines différentes. L’expression différente des gènes (codant notamment pour des protéines homéotiques) dans un embryon joue un rôle clé dans la mise en place du plan d’organisation de l’organisme. Suivant les conditions, les besoins en différentes protéines changent (exemple du stress). Comment étudier l’expression des gènes, à la fois d’un point de vue quantitatif et qualitatif, et d’un point de vue spatial et temporel ? 3) Etude de l’expression des gènes 82

83 3) Etude de l’expression des gènes
a) Quantification des protéines dans un extrait cellulaire Par Western blot : pas de quantification absolue. On peut obtenir des données comparatives qualitatives entre différentes conditions. Un gène de ménage est souvent utilisé comme référence. Par dosage : méthodes spectroscopiques, immunologiques, enzymatiques Indirectement par Northern blot : information sur la quantité d’ARN messager correspondant à la protéine (Rq : une augmentation des ARNm peut provenir d'une augmentation de la transcription ou d'une augmentation de la stabilité des ARNm). Le Northern blot fournit des informations plus quantitatives qu’un Western blot (moins de problème de saturation du signal)

84 3) Etude de l’expression des gènes : b) Les gènes rapporteurs
Le niveau d’expression d’un gène peut être quantifié à l’aide de gènes rapporteurs : remplacement de la portion codante du gène considéré par un gène rapporteur : - gène d'une enzyme (mesure enzymatique) - gène d'une protéine fluorescente (mesure de la fluorescence) Exemple : Remplacement de la séquence codante du gène étudié par la séquence codante d’une enzyme : la luciférase. luciférine (substrat de l'enzyme) Séquences promotrices Séquence codante du gène d’intérêt Séquence de la luciférase Mesure de l'activité enzymatique in vitro avec ajout du substrat. Ce sont des données relatives, qui doivent être comparées à une référence. Luciférase Réaction enzymatique => Emission d'un photon (quantification possible par spectrophotométrie)

85 3) Etude de l’expression des gènes : b) Les gènes rapporteurs
Activité luciférase Gène X quatre fois plus exprimé dans la condition 1 que dans la condition 2 Exemple : niveau d’expression d’un gène X sous deux conditions différentes (1et 2) On obtient des informations sur le niveau d’expression d’un gène dans une cellule à un moment donné, pour des conditions données (résultats quantitatifs contrairement au Western blot)

86 3) Etude de l’expression des gènes : b) Les gènes rapporteurs
Ce genre de construction permet également d’analyser ce qui contrôle l’expression des protéines : Exemple : Cellules A B C D 1 2 Séquence codante du gène X Séquence codante du gène rapporteur Séquences promotrices La séquence régulatrice 1 active l’expression du gène X dans la cellule A, la séquence 2 active l’expression de X dans la cellule C

87 3) Etude de l’expression des gènes : b) Les gènes rapporteurs
Il est possible d’obtenir des animaux transgéniques exprimant les séquences promotrices d’un gène étudié fusionné à un gène rapporteur. La révélation du produit du gène rapporteur sur des embryons à différents stades apporte des informations spatiales et temporelles sur l’expression du gène étudié. Stade 1 : pas d’expression du gène Stade 2 : expression postérieure du gène Exemple :

88 3) Etude de l’expression des gènes : c) Localisation des protéines
Comment localiser notre protéine dans des cellules ? Deux possibilités : 1) Regarder la protéine endogène par immunofluorescence 2) Construire une protéine fusionnée à une protéine fluorescente Dans les 2 cas, l'observation est faite avec un microscope à fluorescence. On peut regarder la localisation de la protéine d'intérêt dans des cellules en culture ou des coupes de tissus. Dans tous les cas, les cellules sont préalablement fixées (elles sont alors immobilisées et les macromolécules sont stabilisées et bloquées en l'état).

89 3) Etude de l’expression des gènes :
c) Localisation des protéines : immunofluorescence Pour localiser des protéines endogènes dans une cellule (ou sur une coupe de tissu), une technique proche du Western blot est utilisée : l'immunofluorescence Cellule fixée sur lamelle et perméabilisée protéine étudiée noyau Reconnaissance de l'anticorps primaire par un anticorps secondaire fusionné à un fluorophore Analyse du signal fluorescent par observation au microscope à fluorescence => localisation de la protéine d'intérêt Détection de la protéine par un anticorps spécifique (anticorps primaire) après incubation avec de la BSA (bovine serum albumine, pour saturer les sites de liaison non spécifiques) lavages lavages noyau

90 3) Etude de l’expression des gènes :
c) Localisation des protéines : fusion à une protéine fluorescente On peut fusionner une protéine fluorescente à l'extrêmité C-terminale ou N-terminale de la protéine d'intérêt. Des plasmides contenant les protéines fluorescentes existent, et contiennent des sites de restriction permettant de cloner la protéine d'intérêt. Ex : fusion à la GFP (Green Fluorescent Protein). La GFP est une protéine issue d'une méduse Aequorea victoria, capable d'émettre une fluorescence verte après excitation par une lumière bleue. protéine d'intérêt GFP Excitation par lumière bleue Emission de fluorescence verte Localisation des protéines dans une cellule par observation au microscope à fluorescence

91 3) Etude de l’expression des gènes : d) Localisation des ARN et ADN
Les ARN et ADN peuvent être localisés dans une cellule ou une coupe de tissus grâce à l'hybridation in situ (FISH en anglais, pour Fluorescent in situ hybridization) : Utilisation d'une sonde fluorescente d'ADN complémentaire de l'ARN ou ADN étudié et visualisation sur un microscope à fluorescence. Pour l'ADN chromosomique : les chromosomes sont préalablement exposés à un fort pH ce qui détruit les appariements de bases de l'ADN. La sonde complémentaire de la région étudiée a alors accès à l'ADN. Pour l'ARN : pas d'exposition à un fort pH pour que l'ADN reste bicaténaire et ne fixe pas la sonde. Fixation douce pour que l'ARN soit conservé dans une forme exposée.

92 3) Etude de l’expression des gènes :
d) Localisation des ARN par Hybridation Fluorescente In Situ (FISH) Les sondes utilisées sont souvent de l'ADN. Elles sont fluorescentes. Autrefois les sondes étaient marquées radioactivement. On peut également trouvé des sondes avec un marquage chimique, détecté ensuite par des anticorps. Protocole : les sondes sont dénaturées. Elles sont incubées avec les cellules fixées et perméabilisées en présence d'ARNt et de BSA pour saturer les sites non spécifiques. Des lavages permettent d'éliminer les sondes non fixées, avant l'observation microscopique.

93 Conclusion : Etude de l’expression des gènes :
Les analyses se font de plus en plus à une échelle globale. Exemple : les puces à ADN permettent de comparer l’ensemble des ARNm présents dans 2 échantillons différents : Collection de molécules d’ADN, spécifiques de gènes, ampifiées par PCR , puis fixées sur une lame de verre ARNm issus de l’échantillon 1 marqués par un fluorochrome rouge ARNm issus de l’échantillon 2 marqués par un fluorochrome vert Hybridation sur la lame, lavages, et analyse des signaux fluorescents Les spots rouges correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans l’échantillon 1 que dans l’échantillon 2 Les spots verts correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans l’échantillon 2 que dans l’échantillon 1 Les spots jaunes correspondent à des gènes exprimés de la même façon dans les deux échantillons et les spots noirs à des gènes non exprimés dans les deux échantillons

94 II) Utilisation de l’ADN recombinant
Approche génétique classique : point de départ, des mutants avec un phénotype intéressant ; puis recherche des gènes impliqués Approche génétique inverse : développée grâce à la technologie de l’ADN recombinant ; il est possible de cibler une mutation dans une séquence donnée. Cette version mutante peut être transférée dans une cellule pour son étude (voir partie B). 4) Etude de la fonction des gènes/protéines

95 4) Etude de la fonction des gènes/protéines a) Approche génétique classique
Mutagenèse aléatoire : par insertion (d’un transposon…), chimique… Recherche du/des gènes impliqués Test de complémentation entre mutants pour savoir si ce sont ou non les mêmes gènes impliqués Localisation du gène impliqué : Séquençage autour de l’insertion après avoir récupéré le fragment correspondant Test de liaison (position relative par rapport à d’autres gènes connus ou séquences particulières) Recherche d’homologies de séquence ; étude de l’expression du gène spatiale et temporelle Crible pour identifier un phénotype intéressant

96 4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse
Comment est obtenue une version mutée d’un gène ? Par PCR mutagène (PCR en présence d’un déséquilibre entre les différents nucléotides et d’un tampon différent) => mutations aléatoires dans la séquence Par mutagenèse dirigée : PCR avec des amorces particulières => insertion d’une mutation à un endroit précis (exemple : modification d’un acide aminé particulier) Exemple : Séquence à muter : cag cgc gat ttc Q R D F => remplacement de l'aspartate par une alanine : Séquence de l'amorce: cag cgc gCC ttc Q R A F ADN matrice à muter : le plasmide entier avec la séquence du gène d’intérêt à muter amorces utilisées pour la PCR Zone de mésappariement de l'amorce avec la matrice, correspondant à la mutation à introduire On fait une PCR sur un plasmide entier avec des amorces présentant un mésappariement (mutation à introduire) avec la matrice

97 plasmide avec la mutation
4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse A la fin de la PCR de la mutagenèse dirigée on se retrouve avec un mélange de plasmides initiaux sans la mutation et de plasmides contenant la mutation Le plasmide initial est méthylé car il a été amplifié dans une bactérie (méthylation de séquences d'ADN spécifiques). plasmide initial Afin de sélectionner les plasmides avec la mutation, traitement par une enzyme qui coupe des séquences d’ADN particulières seulement si elles sont méthylées, puis transformation dans des bactéries. Seul le plasmide muté, non digéré, pourra se répliquer dans les bactéries. plasmide avec la mutation

98 4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : différents types de mutants Mutation avec gain de fonction : souvent liée à la surexpression du gène (le gène peut être placé sous le contrôle d’un promoteur puissant, et sur un plasmide multicopies) Inactivation de gène (knockouts) Mutation effet dominant négatif : Pour une protéine entrant dans la formation d’un complexe, une mutation peut conduire au dysfonctionnement total de ces protéines, y compris des protéines non mutantes : 4 protéines associées en complexe, protéines actives 4 protéines mutantes associées en complexe, protéines inactives 1 protéine mutante dans le complexe, toutes les protéines sont inactivées

99 4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : utilisation des mutants
Etude des phénotypes des mutants Complémentation fonctionnelle : (expériences sur des mutants conditionnels) Banque d’ADNc d’un autre organisme eucaryote, dans un vecteur levure, avec un marqueur de sélection Levures thermosensibles mutantes pour un gène X Transformation des levures, étalement sur milieu sélectif à température permissive (la mutation du gène X ne s’exprime pas) Incubation à température non permissive (la mutation du gène X s’exprime) : seules les cellules ayant une protéine qui complémente le défaut de X poussent Incubation à température permissive : toutes les cellules se développent Si restauration de la fonction X : complémentation fonctionnelle (identification d’un gène équivalent à celui muté chez la levure dans un autre organisme) Rq : ce test peut aussi mettre en évidence des gènes suppresseurs

100 II) Utilisation de l’ADN recombinant : Conclusion
A partir de la séquence partielle en acides aminés, synthèse d’une sonde ADN, hybridation sur banque d’ADN génomique ou ADNc Protéine Gène ou ADNc Clonage dans un vecteur d’expression Production et purification de protéine recombinante