Biologie Moléculaire Travailler avec l’ADN.

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1 Biologie Moléculaire Travailler avec l’ADN

2 Sujets ADN Genomique vs. Vecteur Purification d’ADN plasmidique
Enzyme de restriction Essentielle de la cartographie de restriction

3 ADN Genomique Extra-genomique Prokaryote vs. eukaryote
Circulaire ou linéaire Un ou plus d’un chromosomes Extra-genomique Vecteurs Plasmides

4 Vecteurs Vs Plasmides Vecteur:
Véhicule d’ADN permettant le clonage, maintien et amplification d’une séquence d’ADN Plasmides Virus Chromosomes Tous les plasmides sont des vecteurs Pas tous les vecteurs sont des plasmides

5 Plasmides Petites molécules d’ADN circulaires maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotes Amplification chez les bactéries Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou l’expression d’ADN d’intérêt

6 Caractéristiques des Vecteurs Plasmidiques
Sites de restrictions uniques pour le clonage Origine de réplication (Ori) Marqueur de sélection Gènes de résistance aux antibiotiques

7 Isolation d’ADN Buts Isolation de l’ADN désiré
Chromosomique ou plasmidique? Retirer les autres composantes ADN chromosomique ou plasmidique? Protéines ARN Produits chimiques Sels, détergents, etc.

8 Isolation d’ADN (suite)
Lyse cellulaire Paroi et membrane Enzymatique Chimique Mécanique Isolation de l’ADN désiré Sédimentation différentielle Chromatographie Retirer les autres composantes

9 Isolation d’ADN Plasmidique par Lyse Alcaline (E.coli )

10 Solutions Utilisées Sol. I – Tampon de suspension
Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner Sol. II – Solution de lyse NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN SDS - dissous membranes, denture et lie protéines

11 Solutions Utilisées (suite)
Sol. III- Acétate de potassium Renaturation de l’ADN Précipite SDS Précipite ADN génomique et protéines Isopropanol / Éthanol Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) Sels demeurent solubles TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??

12 Quantification de l’DNA
Déterminer la Conc. d’DNA A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL Déterminer la quantité d’DNA 1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA 1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION

13 Enzymes de Restriction
Clive les liens phosphodiester internes Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Reconnaissent des séquences palindromes

14 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Palindromes
La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brins 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’

15 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’
Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’

16 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C C T G A A G T C C-3’ G-5’ Extrémités franches

17 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Extrémités 5’ protubérantes

18 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C 5’-G G A T C C-3’ C T A G G-5’ Extrémités 3’ protubérantes

19 Compatibilité des Extrémités
Extrémités franches HO P OH O P Compatible

20 Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes HO P OH HO P O Incompatible

21 Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes HO P OH HO P O Incompatible

22 Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes P-CTAG HO GATC-P OH Appariement GATC-P O P-CTAG O Compatible

23 Compatibilité des Extrémités
Extrémités protubérantes P-TCCA HO GATC-P OH Appariement GATC-P OH P-TCCA HO Incompatible

24 Cartographie des Sites de Restrictions

25 L’ADN est-il digéré? ND D1 D2 Doit comparer à un témoin non digéré

26 La digestion est-elle complète?
Doit comparer à un témoin non-digéré ND D1 D2 Partiel Complet

27 Digestion partielle Toutes les molécules cibles ne sont pas coupées à toutes les sites possibles! Génère différents produits intermédiaires

28 Digestion partielle 1 2 3 1 Produit d’une digestion complète 1 + 2
Produit d’une digestion partielle (intermédiaire) 2 + 3 Produit d’une digestion partielle (intermédiaire)

29 Complète Vs Partielle Une digestion complète donne une stoechiométrie de 1:1:1… Le nombre de molécules de chacun des différents fragments est le même! La stoechiométrie d’une digestion partielle est variable: Ex. 1:3:2…

30 Ex. 1 2 3 Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion complète? 3; donc une stœchiométrie de 3:3:3 =1:1:1 Combien de molécules de chacun des fragments seraient générées suite à une digestion partielle?

31 Évaluer la Stœchiométrie sur Gel d’Agarose
Principe La quantité de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est proportionnelle à la taille de l’ADN La quantité de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est proportionnelle à la quantité d’ADN Dans le cas d’une digestion complète, la quantité de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est seulement proportionnelle à la taille de l’ADN Pourquoi?

32 Ex. D1 D2 Stœchiométrie pas respectée Stœchiométrie pas respectée
Stœchiométrie respectée Stœchiométrie respectée

33 Exemples

34 Exemples

35 1ière étape: Déterminer le nombre de coupures
Est-ce que l’ADN a été digéré? Non- Aucune cartographie requise Oui La digestion est-elle complète? La digestion est-elle partielle? Quels produits sont des intermédiaires Combien de fois l’ADN a-t-il coupé Les coupures sont dans le vecteur Aucune cartographie requise Les coupures sont dans l’insertion Cartographie requise

36 Combien de Sites de Restriction est-ce qu’il y a?
ADN linéaire (ex. Chromosome humain) Le nombre de coupures est égal au nombre de fragments moins un ADN circulaire (ex. Plasmide) Le nombre de coupures est égal au nombre de fragments

37 Les coupures sont-elles dans l’insertion ou le vecteur?
M ND V B P E insert B E ? S Taille du vecteur 2.5kpb P B coupe 2 fois dans le vecteur et 0 fois dans l’insertion E coupe 1 fois dans le vecteur et 1 fois dans l’insertion P coupe 1 fois dans le vecteur et 2 fois dans l’insertion

38 2e Étape: Quelles sont les positions des sites de restrictions?
Cartographie relative est faite Les sites de restriction sont cartographiés en relation en un point de référence La position du point de référence doit être connue

39 Dois Déterminer la Taille de l’Insertion
ND V B P E insert B E ? S Taille du vecteur 2.5kpb P Déterminer la taille des fragments issus d’une digestion complète Déterminer la taille totale du plasmide (Somme des tailles) Déterminer la taille de l’insertion (Taille du plasmide - Taille du vecteur)

40 Déterminer les Tailles
Ec P E Enz Distance (cm) Tailles pb P 0.6 0.9 2.1 3000 1100 900 E 0.3 1.9 4500 1000 Donc : Taille du plasmide 5Kpb Taille de l’insertion 5000pb – 2500pb = 2500pb

41 Cartographie du Site P 1.1kbp ou P 1.1kbp P
Impossible puisque le second site doit être dans l’insert! P Insertion (2.5kpb) 0.9kbp ou P 0.9kbp P Impossible puisque le second site doit être dans l’insert! P Insertion (2.5kpb)

42 Cartographie du Site P (Suite)
0.9kbp 1.1kbp P P P Insertion (2.5kpb) Ou Insert (2.5kpb) P 0.9kbp 1.1kbp

43 Déterminer l’Orientation
1.0kbp E E P Insertion (2.5kpb)

44 Déterminer l’Orientation
0.9kbp 1.1kbp P P P Insertion (2.5kpb) 1.0kbp E E Or Insert (2.5kpb) P 0.9kbp 1.1kbp 1.0kbp E E

45 Déterminer l’Orientation
Ec ND P E P+E P+E