Biologie Moléculaire Travailler avec l’ADN.

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1 Biologie Moléculaire Travailler avec l’ADN

2 Sujets ADN Genomique vs. Vecteur Purification d’ADN plasmidique
Enzymes de restriction Cartes de restriction

3 ADN Genomique Extra-genomique Prokaryote vs. eukaryote
Circulaire ou linéaire Un ou plus d’un chromosomes Extra-genomique Vecteurs Plasmides

4 Vecteurs Vs Plasmides Vecteur:
Véhicule d’ADN permettant le clonage, le maintien et l’amplification d’une séquence d’ADN Plasmides Virus Chromosomes Tous les plasmides sont des vecteurs Pas tous les vecteurs sont des plasmides

5 Plasmides Petites molécules d’ADN circulaires maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotes Amplification chez les bactéries Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou l’expression d’ADN d’intérêt

6 Caractéristiques des Vecteurs Plasmidiques
Sites de restrictions uniques pour le clonage Origine de réplication (Ori) Marqueur de sélection Gènes de résistance aux antibiotiques

7 Isolation d’ADN Buts Isolation de l’ADN désiré
Chromosomique ou plasmidique? Retirer les autres composantes ADN chromosomique ou plasmidique? Protéines ARN Produits chimiques Sels, détergents, etc.

8 Isolation d’ADN (suite)
Lyse cellulaire Paroi et membrane Enzymatique Chimique Mécanique Isolation de l’ADN désiré Sédimentation différentielle Chromatographie Retirer les autres composantes

9 Isolation d’ADN Plasmidique par Lyse Alcaline (E.coli )

10 Solutions Utilisées Sol. I – Tampon de suspension
Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner Sol. II – Solution de lyse NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN SDS - dissous membranes, denture et lie protéines

11 Solutions Utilisées (suite)
Sol. III- Acétate de potassium Renaturation de l’ADN Précipite SDS Précipite ADN génomique et protéines Isopropanol / Éthanol Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) Sels demeurent solubles TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??

12 Quantification de l’ADN
Déterminer la Conc. d’ADN A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL Déterminer la quantité d’ADN 1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg ADN 1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng ADN Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION

13 Enzymes de Restriction
Clive les liens phosphodiester internes Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Reconnaissent des séquences palindromes

14 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’ Palindromes
La même séquence est lue dans la direction 5’» 3’ sur les deux brins 5’-G G A T C C-3’ 3’-C C T A G G-5’

15 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’
Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! 5’-G 3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’

16 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C C T G A A G T C C-3’ G-5’ Extrémités franches

17 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C C T A G G A T C C-3’ G-5’ Extrémités 5’ protubérantes

18 Différentes Extrémités sont Générées
3’-C 5’-G G A T C C-3’ C T A G G-5’ Extrémités 3’ protubérantes

19 Compatibilité des Extrémités
Extrémités franches HO P OH O P Compatible

20 Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes HO P OH HO P O Incompatible

21 Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes P-CTAG HO GATC-P OH Appariement GATC-P O P-CTAG O Compatible

22 Compatibilité des Extrémités
Extrémités protubérantes P-TCCA HO GATC-P OH Appariement GATC-P OH P-TCCA HO Incompatible

23 Cartes de Restrictions

24 Cartes de restrictions
Déterminer les positions des site des enzymes de restrictions Cartes d’ADN linéaires Cartes d’ADN circulaires (plasmides) Cartes d’insertions dans un vecteur

25 Approche Déterminer si l’ADN a été digéré
La digestion est elle complète ou partielle? Combien de coupures? Déterminer les positions relatives

26 L’ADN est-il digéré? Comparez au témoin non digéré Échelle Témoin
Quelles échantillons n’ont pas été digérés? 1 et 4 Quelles échantillons ont été digérés? 2 et 3 1 2 3 4

27 La digestion est-elle complète?
Digestion complète Toutes les molécules d’ADN sont clivées à tous les sites possibles Digestion partielle Une fraction des molécules non pas été digéré Partielle non digéré Une fraction des molécules a été digéré, mais pas à tous les sites possibles

28 Digestion complète Digestion

29 Digestion partielle: partielle non digéré

30 Digestion partielle partielle Digestion

31 La digestion est-elle complète ou partielle?
Échelle Témoin 1 2 3 4 Comparez au témoin Vérifiez l’intensité des bandes Vérifiez les tailles

32 Combien de coupures? Déterminer les positions relatives
Nombre de sites ADN circulaire = nombre de bandes ADN linéaire = nombre de bandes – 1 Déterminer les positions relatives La taille des fragments représente la distance entre les sites

33 Cartes d’ADN linéaires
Enzyme Fragments (Kb) HindIII 3 et 4 SalI 2 et 5 HindIII + SalI 2 et 3 7.0 3.0 4.0 HindIII HindIII + SalI 2.0 3.0

34 Cartes d’ADN circulaires (plasmides)
Enzyme Fragments (Kb) BamHI 2, 3 et 5 HindIII 1 et 9 BamHI + HindIII 1, 1.5, 2, 2.5 et 3 3.0 2.0 1.0 1.5 2.5 7.0 10.0 1.0 9.0 10.0

35 Cartes d’insertions Site d’insertion SCM SCM Plasmide recombinant
Vecteur SCM

36 Approche Déterminer la taille totale
Déterminer la taille de l’insertion Taille totale – taille du vecteur Déterminer le site d’insertion dans le SCM Déterminer quelles enzymes coupent dans l’insertion Cartographie en relation aux sites de positions connues

37 Cartes d’insertions Taille totale Taille de l’insertion
7.7Kb Taille de l’insertion 7.7 – 2.7 = 5.0Kb Site d’insertion Génère 2 fragments dont un est la taille du vecteur XbaI Enzyme Fragments BamHI 7.7Kb EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0

38 Cartes d’insertions Sites a cartographier Enzyme Fragments
Coupures totales Coupures vecteur Coupures insertion BamHI 7.7Kb 1 EcoRI 1.0, 3.0, 3.7Kb 3 2 PstI 2.0 et 5.7 XbaI 2.7 et 5.0 Site d’insertion

39 Cartographie de PstI : 2 et 5.7Kb
5.0

40 Cartographie de EcoRI: 1, 3 et 3.7Kb
1.0 3.0 1.0 1.0 3.0