UICC HPV and CERVICAL CANCER CURRICULUM.

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1 UICC HPV and CERVICAL CANCER CURRICULUM

2 Slide Chapitre 2.d. Dépistage et Diagnostic Recherche et identification des virus HPV Prof. Suzanne Garland MD Director of Microbiological Research, Head of Clinical Microbiology and Infectious Diseases The Royal Women's Hospital Melbourne, Australia Associate Prof. Sepehr Tabrizi Senior Research Scientist, Department of Microbiology 01 Ce module présente la structure du papillomavirus humain et la méthodologie pour le détecter.

3 02 Des particules identiques au virus (virus like particles :VLPs)
Slide Des particules identiques au virus (virus like particles :VLPs) 02 Analogues non infectieux de virus pathogènes VLP-L1 assemblés in vitro dans des capsides virales vides ou ‘VLPs’ La production de ces VLPs n’est pas standardisée Différents systèmes d’expression, de méthodes de préparation, et de contrôle de qualité sont utilisés Les formats d’identification varient (direct vs. indirect) Pas de gold-standard pour définir la positivité Peu de comparaisons inter-laboratoires Les vaccins actuellement autorisés sont constitués de particules qui reproduisent la structure du virus naturel. Mais ces particules ne sont pas infectieuses car elles ne contiennent pas de DNA viral. Les particules s’auto-fabriquent à partir des protéines de la capsule virale: L1 est la principale protéine de structure des virus HPV , tandis que L2 est la seconde. Les particules s’assemblent dans des cellules en culture par la surexpression de la protéine L1 seule ou L1 et L2 ensemble. Différentes variétés de cellules contenant le virus de la vaccine ou le virus Semliki Forest ou le baculovirus ou celui de yeast sont utilisées pour produire les VLPs. Ces particules se sont avérées très immunogèniques. Un certain nombre de systèmes de cellules eucaryotes sont disponibles pour induire l’expression des protéines recombinantes. Ces différents systèmes peuvent aboutir à des modifications d’assemblage induits par les protéines recombinantes. Ceci peut entraîner des propriétés différentes en particulier d’immunogénicité; le choix des systèmes d’expression est donc important pour la création du vaccin.

4 Virus-like particles (VLPs)
Slide Virus-like particles (VLPs) 03 Les VLPs peuvent être analysées en utilisant la microscopie électronique La structure des VLPs peut être étudiée grâce au microscope électronique. Cette image montre un groupe de VLPs. Les protéines de structure qui permettent leur assemblage sont clairement visibles.

5 Détection des anticorps HPV
Slide Détection des anticorps HPV 04 Anticorps Leur présence traduit une infection passée ou présente Ils peuvent être induits par les protéines virales précoces (E) ou tardives (L) L’anticorps neutralisant L1 est celui qui confère au vaccin son rôle préventif. Les anticorps vis à vis des papillomavirus peuvent être détectés dans le sérum et dans la muqueuse cervicale. Leur présence traduit une infection passée ou présente Tous les sujets ne deviennent pas séropositifs à l’HPV, seulement environ % des femmes deviennent séropositives à HPV, et le temps moyen pour obtenir cette séroconversion est de 8 mois. Les anticorps sont dirigés contre la protéine HPV L1 de la capside ou contre les protéines précocement exprimés au cours de la réplication intracellulaire telles que E6 ou E7 .

6 Détection des anticorps HPV
Slide Détection des anticorps HPV 05 Différents tests ont été développés pour détecter les anticorps dans le sérum ou dans la muqueuse cervicale : Enzyme liée à un immuno-absorbant (test ELISA): mesure les Immunoglobulines (Ig) totales, neutralisantes et non neutralisantes Test de liaison compétitive, i.e. essai Luminex (cLIA): mesure les Ig neutralisantes au niveau d’un seul épitope, mais toutes les classes d’Ig. Test avec pseudo-virion : mesure toutes les sous-classes des Ig neutralisantes totales, Test Western blot Radio-immuno-précipitation Les tests les plus courant détectent les anticorps contre HPV L1, la principale protéine de capside, et sont spécifiques pour les différents HPV. Le test enzymatique lié à un immunoadsorbant (test ELISA) ou le test de liaison compétitive sont les plus fréquemment utilisés. Avec ces tests les anticorps spécifiques de la capside de l’HPV sont détectés. Les protéines E6 et E7 peuvent se détecter par test ELISA, western blot ou radio-immunoprécipitation. Les différents tests mesurent différentes choses. Certain, comme l’essai Luminex (cLIA), mesure les anticorps spécifiques d’un épitope, d’autres (comme l’ ELISA) mesure les anticorps totaux.

7 06 Détection de l’HPV DNA dans les tissus par microscopie Slide
Immuno-histochimie (antigène spécifique de groupe) Frottis cervical : détecte les cellules pré-cancéreuses Les techniques d’Immunohistochimie sont couramment utilisées pour visualiser directement la présence de protéines HPV en utilisant dans les tissus et les cellules un anticorps spécifique du virus HPV. Le frottis cervical (Pap smear) a été décrit par le Dr. Papanicolaou en Il a passé l’épreuve du temps et montré que, quand il est réalisé avec une bonne technique, soumis à un contrôle de qualité et intéressant la bonne population, tant l’incidence que la mortalité des cancers du col peuvent être réduites. Cependant il est relativement coûteux et a une sensibilité faible. Du fait que le cancer se développe lentement à partir des premières anomalies cellulaires ,la cytologie doit être répétée régulièrement. Son rôle principal est de détecter les lésions précurseurs (dysplasies de haut grade). Elles peuvent alors être traitées et ceci peut empêcher le cancer de se développer. La cytologie cervicale détecte bien les cellules cancéreuses de type épidermoïdes, moins bien les cellules d’adénocarcinomes. Ces dernières sont localisées dans l’endocol et plus difficile à atteindre avec les techniques de prélèvement de routine.

8 07 Détection de l’ HPV DNA par des Techniques Moléculaires Slide
Méthodes d’ amplification Amplification du Signal Hybride Capture (HC2) Amplification de la cible PCR (Polymerase chain reaction) HPV DNA HPV mRNA (acide ribonucléique messager) La détection immunologique des HPV peut être difficile du fait que les protéines tardives de capside sont seulement exprimées au cours de l’infection productive et que les protéines précoce sont exprimées seulement en petite quantité. L’HPV DNA peut être détecté dans le col, le vagin, et les organes génitaux externes en utilisant des méthodes qui détectent et identifient les types spécifiques d’ HPV et les groupes (tels que les HPV bas risque et les HPV haut risque). L’HPV DNA peut être amplifié sélectivement par une série de réactions qui conduisent à augmenter le nombre de séquences virales présentes dans l’échantillon biologique. Les procédures de collecte, de conservation des spécimens, et de préparation doivent être étudiées lorsque l’on choisi la technique adéquate de détection de l’ HPV DNA. Les génomes HPV et leurs transcrits peuvent être détectés en utilisant des techniques d’ hybridisation telles que l’ Hybride Capture 2, une méthode basée sur la cytologie en phase liquide. D’autres méthodes de détection incluent l’utilisation de PCR (polymerase chain reaction) , qui amplifie l’ HPV DNA en augmentant les séquences virales présentes dans les cellules ou des fragments de tissu (amplification de la cible). Il y a deux approches principales utilisées dans la détection des HPV par la polymerase chain reaction (PCR): PCR consensus et PCR spécifique du type de virus.

9 Test Hybride Capture 2 08 Slide Actuel test approuvé par la FDA
1995 format tube ; 1999 format micro-titre Utilisant les cellules cervicales exfoliées Le matériel recommandé pour le prélèvement comprend une brosse et le milieu de transport Le prélèvement doit contenir des cellules endo et exo cervicales Dans le test Hybride Capture 2, la cible est le DNA trouvé dans le spécimen est initialement dénaturé et hybridé avec un cocktail de sondes spécifiques d’ HPV RNA . Les hybrides RNA-DNA résultants sont capturés à la surface d’une microplaque couverte d’anticorps spécifiques de ces hybrides RNA-DNA. Les hybrides immobilisés réagissent avec des anticorps conjugués à une phosphatase alcaline spécifiques des hybrides RNA-DNA, et sont détectés par un substrat chimio luminescent. Plusieurs molécules de phosphatase alcaline sont conjuguées à chaque anticorps. De nombreux anticorps conjugués se lient à chaque hybride capturé , ce qui entraîne une amplification importante du signal. Comme le substrat est coupé par la liaison avec les phosphatases alcalines une lumière est émise et mesurée par un luminomètre en unité de lumière relative (RLUs). L’intensité de la lumière émise traduit la présence ou l’absence du DNA ciblé dans le spécimen.

10 Test Hybride Capture 2 09 Slide
Il a la sensibilité d’un échantillon contenant génomes Sondes de type bas risque HPV types 6, 11, 42, 43, 44 Sondes de type haut risque HPV types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 and 68 Résultats non spécifiques du type dans le groupe HR ou BR Pas de contrôle sur le nombre de cellules recueillies Bonne comparaison inter laboratoire Le test Hybrid Capture® 2 permet de détecter 5 types d’HPV à bas-risque et 13 à haut-risque, dont les plus fréquents HPV-16 et HPV-18. Pour chaque spécimen testé, le résultat informe le médecin sur la positivité de son patient en terme d’HPV à haut ou bas risque ou les deux, ou s’il est négatif. Le test n’identifie pas le type spécifique d’HPV présent, mais seulement sur le groupe haut ou bas risque. Tous les patients présentant un HPV à haut risque suivront le même protocole de suivi quelque soit le type d’HPV haut risque présent.

11 PCR:Polymerase Chain Reaction
Slide PCR:Polymerase Chain Reaction 10 Très sensible: copies /100,000 cellules Permet de tester divers échantillons Permet aussi de tester des échantillons archiver et dont la qualité du DNA est pauvre Consensus sur le test : La cible est généralement la région L1 Mais - Les initiateurs d’amplification (primers) varient: MY09/MY11 SPF1/SPF2 PGMY09/PGMY11 GP5+/GP6+ Le système de détection varie: ELISA Dot blot Le test PCR est basé sur l’amplification de la cible et peut être utilisé pour détecter le DNA spécifique du génotype de l’ HPV présent. De très petites quantités de DNA peuvent être détectées avec cette technique. Le problème de ce test est lié à sa haute sensibilité car des impuretés, ou une contamination croisée, peut aboutir à un faux positif. Il existe différentes techniques de PCR qui peuvent être utilisées pour augmenter les séquences virales, et le choix dépend de plusieurs facteurs: la région ou le gène auquel on s’intéresse , par exemple la région L1 ou E6, et aussi la spécificité recherchée. Les produits amplifiés peuvent être analysés par diverses techniques ELISA, hybridisation ou dot-blot.

12 Différentes techniques de PCR
Slide Différentes techniques de PCR 11 Test AMPLICOR ® HPV LINEAR ARRAY® HPV Test INNO-LiPA ® Genotyping Génotypage HPV sur pièce en paraffine Les Tissus peuvent être vieux et le DNA dégradé (y compris durant l’extraction) Basé sur l’amplification et la détection de 13 HPV de type haut risque, le test AMPLICOR HPV, proposé par le laboratoire Roche, est un test hautement spécifique où la limite basse de détection est de 100 copy/PCR ou moins pour tous les HPV à haut risque. Généralement, il n’y a pas de réactivité croisée avec les types d’HPV à bas risque. De plus des tests ont été réalisés sur 61 autres micro-organismes qui peuvent être présents dans les prélèvement génitaux. Les tests sont très reproductibles entre les opérateurs d’un même laboratoire et d’un jour à l’autre. Le test “Linear Array” pour le génotypage HPV de Roche Diagnostic utilise un initiateur ( primer) pour définir une séquence de nucléotides dans la région L1 du génome de l’ HPV qui est approximativement de la longueur de 450 paires de base. Un pool d’initiateurs( primers) est identifié pour amplifier l’ HPV DNA à partir de 37 génotypes incluant 13 génotypes de haut risque. Une paire supplémentaire d’indicateur cible le gène de la béta globuline humaine pour avoir un contrôle de la possibilité d’extraction et d’amplification de la cellule. Le test INNO-LiPA HPV Genotyping du laboratoire Innogenetics, est aussi basé sur le principe de l’hybridisation inversée similaire au linear array. Une région beaucoup plus petite (65 paires de base ) de L1 du génome HPV est amplifiée utilisant des initiateurs biotinylés et dénaturés. Ces initiateurs sont hybridés avec des sondes d’oligonucléotides spécifiques immobilisés sur un support . Après hybridisation et lavage, une phosphatase alcaline conjuguée à la streptavidine est ajoutée et se lie avec les hybrides biotinylés précédemment formés. Une Incubation avec un colorant donne un précipita brun/violet et le résultat peut être interprété visuellement. Une biopsie préparée en bloc de paraffine peut être endommagée par la fixation et l’archivage du bloc, ce qui peut ensuite impacter sur la qualité du DNA présent. Une méthode sensible et adéquate de détection du DNA de l‘HPV sur les blocs de paraffine est donc importante . Ce test utilisant l’amplification d’une cible plus courte ( 65 paires de base) , augmente la probabilité de détection d’un DNA en partie dégradé et, de ce fait, est plus sensible pour l’évaluation de la présence du DNA viral dans les tissus archivés.

13 Différentes techniques de PCR
Slide 12 Différentes techniques de PCR HPV DNA Chip format (Bio-puce) HPV Microarray (Puce à ADN) Les méthodes de détection de l’HPV utilisant la PCR nécessitent l’amplification des zones du génome par des sondes d’oligonucléotides spécifiques. Le test CHIP a été créé pour détecter et génotyper le DNA HPV amplifié . Il est préparé en immobilisant les sondes d’ oligonucléotides de 22 types d’ HPV et d’un contrôle (béta-globine), et peut détecter de multiples types d’HPV. Un scanner laser est nécessaire pour la détection. La technique de DNA microarray de haute densité fait partie des tests de nouvelle génération pour détecter les HPV à haut risque. Elle consiste à utiliser des milliers de spots microscopiques d’oligonucléotides de DNA chacun contenant des pico moles d’une séquence spécifique du DNA. L’hybride ciblé par la sonde est généralement détecté et quantifié par une substance fluorée ou argentée ou luminescente.

14 Autres méthodes de détection des types d’HPV
Slide Autres méthodes de détection des types d’HPV 13 Luminex’s xMAP® Norchip - HPV Proofer D’autres nouvelles approches de détection des HPV sont en cours. Des techniques de perles en suspension (xMAP, Luminex Corporation) permettent l’analyse simultanée des anticorps anti-HPV spécifiques d’une centaine d’antigènes différents en une seule réaction et peuvent permettre le screening de 1000 sérums par jour. Cette méthode a été développée à partir de technologie existante ( cytométrie en flux, microsphères, lasers, signal digital, et chimie traditionnelle). Le DNA peut être et génotypé sur des perles Luminex en utilisant des sondes hybridées. Le test Norchip HPV proofer est basé sur la détection de E6/E7 m-RNA, ciblant les types HPV oncogènes. Cette technologie est encore en évaluation.

15 Limitations et challenges
Slide Limitations et challenges 14 Divers niveaux de test Différentes sensibilité et spécificité Manque de contrôles, et d’assurance de Qualité Différents tests peuvent être utilisés; ils sont basés sur la morphologie cellulaire ( cytologie, histologie), ou sur la détection des protéines cellulaires (immunohistochimie), ou sur la détection du génome des HPV (méthodes directes , amplification du signal, amplification de la cible) et enfin sur la détection des anticorps anti-HPV. Il y a de grandes variations entre ces différents tests de détection des HPV en termes de sensibilité et de spécificité.

16 15 Utilisation pratique des tests de détection des HPV Slide Clinique
Dépistage Triage des frottis douteux ou difficile (ASCUS) Suivi après traitement des CIN (néoplasie intra-epithéliale) Epidémiologie Surveillance géographique Taux de prévalence des différents HPV dans le monde Vaccin Etude Pré- and post pour la mise en place de la vaccination Efficacité des essais de vaccination Les méthodes pour rechercher les HPV peuvent être utilisées pour différentes raisons comme en clinique, pour la surveillance des types d’HPV et l’estimation de leur prévalence dans les différents pays ou régions. Pour introduire un programme de vaccination il est important de connaître la prévalence des différents HPV oncogènes. Lorsque la vaccination a été introduite, ces méthodes permettent d’évaluer l’impact du programme sur les différents types d’HPV.

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Slide 16 merci Cette présentation est disponible sur le site: Merci de votre attention. Cette présentation peut être téléchargée depuis le site de l’UICC.