Extraction et purification de la LDH de lapin - jour 1

Présentation au sujet: "Extraction et purification de la LDH de lapin - jour 1"— Transcription de la présentation:

1 Extraction et purification de la LDH de lapin - jour 1
Roles de la LDH: cycle de Cori pyruvate lactate réaction enzymatique

2 J3 biomol - PCR parfaites pour presque tous

3 J3 biomol - PCR contamination ? amplification partout
Contrôles -ve OK, mais…

4 J3 biomol - ARN bonnes preps pour tous (beaucoup mieux que l'année passée!)

5 J3 biomol - ARN par contre… pour ~50% dégradation lors de la préparation des échantillons à déposer ?

6 J3 biomol - lacunes ne pas mettre du GelRed dans vos gels ??? (c'était vos 4ième et 5ième gels!!!) pieds des cylindres pas enlevés (on était à votre 5ième journée en labo!) pipettes sales dans les bacs de vaisselle sales au lieu d'être dans le cylindre nettoyer les balances (plateau et intérieure) et les alentours

7 # de ug d'oligo dans la réaction de PCR
Compte rendu #3 - Q5 # de ug d'oligo dans la réaction de PCR 40 uM 2,5 ul 120 ul

8 préparer des extraits bruts de la LDH de lapin
LDH - buts préparer des extraits bruts de la LDH de lapin muscle autres tissus/organes comparer les niveaux d'activité de la LDH dans les divers tissus (activité spécifique) purifier la LDH de muscle de lapin mettre en évidence la purification de la LDH effectuée à l'aide d'un immunobuvardage analyser les isoenzymes de la LDH présentent dans les divers tissus de lapin

9 LDH - objectifs - techniques à maitriser
techniques de purification des protéines dosage d'activité enzymatique dosage de la [protéines] (= Bradford) analyse par « Western blot » (immunobuvardage = SDS-PAGE + électroblot) analyse des isoenzymes par gel d'activité (= gel natif) 1. préparation d'un extrait brut 2. précipitation au sulfate d'ammonium 3. colonnes de dessalage et d'affinité activité spécifique (U/mg)

10 Compte rendu 1: 5 % 12 septembre Compte rendu 2: 5 % 31 octobre
LDH - évaluation Valeur Date de remise Compte rendu 1: 5 % septembre Compte rendu 2: 5 % octobre Compte rendu 3: 5 % novembre Rapport 85 % novembre (consignes: web) l'heure de remise est 8h30 À noter: l'examen final est le 21 nov (= ne pas attendre à la dernière minute pour le rapport)

11 1. d’un tissu/organe de lapin (2,5 g tissu/prep)
LDH - manips/équipe 2 extrait bruts / équipe 1. d’un tissu/organe de lapin (2,5 g tissu/prep) 2. de muscle de lapin (2,5 g tissu/prep)

12 1. d’un tissu/organe de lapin (2,5 g tissu/prep)
LDH - manips/équipe 2 extrait bruts / équipe 1. d’un tissu/organe de lapin (2,5 g tissu/prep) 2. de muscle de lapin (2,5 g tissu/prep) activité spécifique de la LDH dans les 2 partage des résultats (tableau #1) (4 tissus + 4 muscles, voir site web) purifie et caractérise uniquement la LDH musculaire de lapin gardez les extraits bruts pour gel d'activité (J3)

13 LDH catalyse la réaction
Introduction LDH catalyse la réaction catalyse la réaction dans les 2 sens muscle: pyruvate → lactate (fin de glycolyse) foie: lactate → pyruvate (gluconéogenèse, cycle de Cori) pyruvate lactate

14 Cycle de Cori

15 LDH catalyse la réaction
Introduction LDH catalyse la réaction NADH absorbe à 340 nm facile de suivre la réaction (direction lactate = disparition de NADH; A340 ↓ ) (direction pyruvate = production de NADH; A340 ↑ ) pyruvate lactate

16 BCM311 pyruvate + NADH (direction lactate), alors on suit la disparition de NADH pyruvate lactate

17 Activité enzymatique - linéarité
Phase 1 la quantité de produits qui apparaît est linéaire en fonction du temps la vitesse est constante et = Vo

18 Activité enzymatique - linéarité
Phase 2 temps de réaction trop long, induit des irrégularités la vitesse n'est pas constante (inactivation de l'enzyme, inhibition par un produit, compétition avec réaction inverse, épuisement d'un substrat)

19 1. d’un tissu/organe de lapin (2,5 g tissu/prep)
Organigramme 2 extrait bruts / équipe 1. d’un tissu/organe de lapin (2,5 g tissu/prep) 2. de muscle de lapin (2,5 g tissu/prep) partage des résultats à la table (tableau 1) (4 tissus + 4 muscles, voir site web) purifie et caractérise uniquement la LDH musculaire de lapin

20 Organigramme

21 Jour 1 tissu assigné muscle avec l'extrait de muscle seulement

22 tissu de lapin Jour 1

23 tissu de lapin Jour 1 homogénéisation

24 tissu de lapin Jour 1 homogénéisation centrifugation

25 tissu de lapin Jour 1 homogénéisation centrifugation surnageant culot

26 devrait contenir la LDH dosages (activité enzymatique + protéines)
tissu de lapin Jour 1 homogénéisation extrait brut devrait contenir la LDH dosages (activité enzymatique + protéines) gardez des échantillons pour les gels (J3) fin pour autres tissus (à part du gel d'activité) centrifugation surnageant culot

27 Jour 1 avec l'extrait de muscle seulement tissu de lapin
homogénéisation centrifugation avec l'extrait de muscle seulement surnageant culot ppt au (NH4)2SO4 (0-40%)

28 Jour 1 Ne pas jeter! LDH devrait être ici. tissu de lapin
homogénéisation centrifugation surnageant culot ppt au (NH4)2SO4 (0-40%) culot (P 0-40) surnageant (S 0-40) Ne pas jeter! LDH devrait être ici.

29 Jour 1 tissu de lapin homogénéisation centrifugation surnageant culot
ppt au (NH4)2SO4 (0-40%) culot (P 0-40) surnageant (S 0-40) ppt au (NH4)2SO4 (40-70%)

30 LDH Jour 1 ne pas jeter tissu de lapin homogénéisation centrifugation
surnageant culot ppt au (NH4)2SO4 (0-40%) culot (P 0-40) surnageant (S 0-40) ppt au (NH4)2SO4 (40-70%) ne pas jeter surnageant (S 40-70) culot (P 40-70) LDH

31 Dosages tissu de lapin homogénéisation centrifugation surnageant culot
ppt au (NH4)2SO4 (0-40%) culot (P 0-40) surnageant (S 0-40) ppt au (NH4)2SO4 (40-70%) surnageant (S 40-70) culot (P 40-70)

32 préparation des solutions
Points techniques préparation des solutions BSA 1 mg/ml / Tris-Cl 50 mM pH 7,4 (préparer 25 ml / table) (garder pour J2) NADH 2 mM / Tris-Cl 50 mM pH 7,4 (préparer 20 ml par table) NaPyruvate 7,5 mM / Tris-Cl 50 mM pH 7,4 (préparer 20 ml par table) Solution de Bradford diluée 1/5 et filtrée (préparer 250 ml par table) (garder pour J2) TRIS 50 mM pH 7,4 (préparer 2 L par table) (garder pour J2 et J3) 1 éq/table prépare le tampon d'extraction préparer le TRIS en premier, car c'est requis pour le tampon d'extraction foie en premier

33 Points techniques gardez TOUT afin de s’assurer du résultat final gardez les échantillons INDIQUÉES (dosages + gels, voir organigramme) bien identifiez vos échantillons manque d'échantillons = perte de points (-5 % de la note sur le rapport/échantillon) bien laver les homogénéisateurs SDS-PAGE et activité

34 Points techniques dosages enzymatiques = réactifs à TP n’attendez pas entre l’ajout de l’enzyme et début des lectures de ΔA340 noter la A340 au début + fin du dosage

35 Points techniques - spectrophotomètres
deux sortes: et 2100 instructions dans Annexe 1

36 noter les ΔA340 chaque 10 secondes (directement dans cahier)
Spectro 2000 pyruvate lactate noter les ΔA340 chaque 10 secondes (directement dans cahier) vérifier que les ΔA340/10 sec sont constants (= réaction linéaire pendant 1 minute) convertir les ΔA340/10 sec en ΔA340/min 0,1 < ΔA340/min < 1,0 temps ΔA340 10 sec ,057 ,058 ,056 ,057 ,058 ,058 ΔA340 /min = 0,344 _ - temps ΔA340 10 sec ,057 ,058 ,056 ,032 ,008 ,001 ΔA340 /min = ? _

37 Spectro 2100 indique le ΔA340/min prenez le temps d’apprendre à utiliser les 2

38 Points techniques - Bradford
ne pas forcer la courbe à passer par le zéro pas d’extrapolation A595

39 Points techniques - Bradford
ne pas forcer la courbe à passer par le zéro pas d’extrapolation A595

40 Points techniques - Bradford
inconnus tombent sur la courbe vérification par ordinateur (apporter) attention: interpolation avec GraphPad (voir le site internet)

41 Bradford avec GraphPad
calcul les barres d'erreur automatiquement

42 Bradford avec GraphPad
calcul les barres d'erreur automatiquement A595

43 Bradford avec GraphPad
calcul les barres d'erreur automatiquement A595

44 Bradford avec GraphPad
calcul les barres d'erreur automatiquement A595

45 Bradford avec GraphPad

46 Bradford avec GraphPad

47 Points techniques - dilutions
1:20 ou 1/20 1 volume de l'échantillon 20 volumes final (c.-à-d. 19 volumes diluant) facteur de dilution = 20 (toujours >1)

48 Points techniques - méthode de Layne
autre méthode pour calculer la [prot] implique des lectures d'absorption à 260 et 280 nm utilisez les cuvettes « UV » et non celles dans vos tiroirs

49 Cahier beaucoup de résultats inscrire le tout directement dans le cahier organisation clarté

50 Calcul des unités de la LDH
1 unité LDH = ±1 µmole de NADH/min à TP et pH 7,4 voir p.LDH-34 pour un exemple assurez-vous de comprendre comment calculer les U/ml sans utiliser la grosse formule

51 Être efficace

52 Points techniques - solutions
préparation des solutions BSA 1 mg/ml / Tris-Cl 50 mM pH 7,4 (préparer 25 ml / table) (garder pour J2) NADH 2 mM / Tris-Cl 50 mM pH 7,4 (préparer 20 ml par table) NaPyruvate 7,5 mM / Tris-Cl 50 mM pH 7,4 (préparer 20 ml par table) Solution de Bradford diluée 1/5 et filtrée (préparer 250 ml par table) (garder pour J2) TRIS 50 mM pH 7,4 (préparer 2 L par table) (garder pour J2 et J3) 1 éq/table prépare le tampon d'extraction

53 Points techniques - échantillons à garder
responsabilité des équipes (-5% par échantillon manquant) boîte à 4oC / table, 1 boîte à -20oC / table bien les identifiés (tous les équipes ont les mêmes échantillons) échantillons (extraits bruts) pour les gels (SDS-PAGE et activité - J3) coeur (à 4oC (majorité) et à -20oC (100ul) ) foie (à 4oC) muscle (à 4oC (400ul) et à -20oC (100ul) ) rein (à 4oC)

54 LDH Questions Roles de la LDH: extraction purification
cycle de Cori pyruvate lactate réaction enzymatique

55 J3 biomol - ARN moins d'ADN génomique comme vu dans le passé (photos de 2016)