Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2

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1 Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 2
Carbamyl phosphate carbamylaspartate ATCase

2 BCM311 - rappel comportement
embouts boite vide boîte moitié vide - retourner au buffet - remplir (gants) et mettre à l'endroit pour stérilisation ultérieure (ne pas remettre au buffet)

3 BCM311 - rappel comportement
verrerie enlever toutes les étiquettes pipettes sales ménage remplir flacons laveurs vider poubelles de table nettoyer autour des balances désinfecter vos paillasses récupération de verre ≠ une poubelle vérification du contenu du tiroir

4 BCM311 - rappel comportement
cahiers inscrire le tout directement TRÈS important cette semaine vu la quantité de résultats qui seront générés présence de: -titres des tableaux -unités -exemples de calculs (ex. dilutions) -détails des solutions que vous avez préparées

5 Jour 1 - courbe standard variabilité (attn au technique de pipetage!) n'oubliez pas de forcer la line par l'origine lors de la régression linéaire

6 Jour 1 - tests des dilutions
de superbes résultats dilutions à utiliser: entre 1/1000 et 1/3000

7 Jour 1 - allostérie toutes les préparations suivent très bien le modèle sigmoïde allostérique

8 Dilution de l'enzyme - rappel
Ex. : 3 ml d'une dilution 1/2000

9 ATCase est une enzyme allostérique
ATCase - but ATCase est une enzyme allostérique 1ère semaine - préparation de l'enzyme détermination de la dilution étudier les propriétés cinétiques de aspartate transcarbamylase (ATCase) d'E. coli vitesse

10 Organigramme - semaine 2
effecteurs d’ATCase (séries A, B et C) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de CTP (Série B) Dosage d’ATCase en présence d’ATP (Série C) Courbe standard de carbamyl aspartate

11 Organigramme - semaine 2
désensibilisation du site allostérique (A,D+E) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de Hg (Série D) Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP (Série E)

12 Organigramme - semaine 2
effecteurs d’ATCase (séries A, B et C) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de CTP (Série B) Dosage d’ATCase en présence d’ATP (Série C) Courbe standard de carbamyl aspartate

13 Biosynthèse des pyrimidines
CTP est un inhibiteur d'ATCase ATP est un activateur d'ATCase assure une production égale de purines + pyrimidines

14 Vmax ne change pas Kprime change ATCase
À noter: ►Kprime n'est pas la [S] à Vmax/2 ►ici à titre d'exemple seulement +CTP +ATP Vmax ne change pas Kprime change

15 ATCase enzyme allostérique: cinétique non-michaelienne

16 BCM311 - résultats typiques
+CTP +ATP

17 Michaelis-Menten d'ATCase

18 Organigramme - semaine 2
désensibilisation du site allostérique (A,D+E) Préparation d’ATCase de la première semaine Dosage d’ATCase sans effecteur (Série A) Dosage d’ATCase en présence de Hg (Série D) Dosage d’ATCase en présence de Hg + CTP (Série E)

19 Structure d'ATCase - séries A, D + E
enzyme native, C6R6, 300 kDa

20 Structure d'ATCase - séries A, D + E
sous-unité catalytique (C3) catalysent encore la réaction souvent plus active que l’holoenzyme cinétique michaelienne (courbe hyperbolique) pas sous la régulation de CTP ou d’ATP

21 Structure d'ATCase - séries A, D + E

22 Structure d'ATCase - effet de Hg
ATCase+Hg plus active que native courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP

23 Structure d'ATCase - effet de Hg

24 Structure d'ATCase - effet de Hg
ATCase+Hg plus active que native courbe hyperbolique ATCase ne répond plus à CTP

25 Points techniques préparer suffisamment d’enzyme diluée pour effectuer les séries en question (A-C ou A+D+E) diluer l’enzyme immédiatement avant son utilisation garder l’enzyme sur glace en tout temps sauf durant l’incubation

26 Lunettes et gants obligatoire
Points techniques Lunettes et gants obligatoire préparer le réactif (attention: H2SO4) colorimétrique juste avant son utilisation (protège-le de la lumière) préparer seulement le volume du réactif requis: - A+B+C (~135 ml; tubes = 114 ml) - A+D+E (~105 ml; 27 tubes = 81 ml) lire les DO rapidement après la terminaison des réactions: la couleur diminue avec le temps

27 Points techniques Réactions à 30oC (bains personnels) réactifs (tubes) préchauffés laissez des intervalles assez longs vérifiez la température des bains

28 préparation des solutions
Points techniques préparation des solutions aspartate 125 mM (préparer 50 ml / table) carbamyl phosphate 36 mM (préparer 50 ml / table) solutions préparées semaine I acide perchlorique 2% tampon sodium phosphate 0,16 M pH 7,0

29 Points techniques Études cinétiques = précision chronométrage concentrations/dilutions/volumes homogène température

30 ATCase - questions ? Carbamyl phosphate carbamylaspartate aspartate

31 ATCase - graphique de Hill
log (V/Vmax-V) vs log [aspartate] pente = nh besoin de Vmax Vmax historiquement déterminé à l’aide des graphiques "linéaires" de Lineweaver-Burk et d'Eadie-Hofstee

32 ATCase - graphique de Hill
pour un enzyme allostérique, la courbe M+M est sigmoïde

33 ATCase - graphique de Hill
alors, les graphiques linéaires (LB et EH) ne sont pas Comment déterminer Km et Vmax ?

34 Régression non-linéaire ("Curve fitting")
logiciels puissants (Graphpad) utilise le formule MM pour les enzymes allostériques et détermine Vmax, Kprime et nH pour que la courbe tracée suit les données

35 Régression non-linéaire ("Curve fitting")
native +CTP +ATP

36 GraphPad 6 - utilisation dans BCM311
présentation PowerPoint disponible sur le site internet du cours régression linéaire (courbe standard) régression non-linéaire (Michaelis-Menten) comparaison de modèles (ex. MM vs sigmoïde)

37 ATCase - résultats cibles/analyse
Effecteurs allostériques Désensibilisation Michaelis-Menten Lineweaver-Burke Eadie-Hofstee Hill n = 2+ native: sigmoïde +Hg: michaelienne native: recourbée +Hg: linéaire native n = 2+ +Hg n = 1

38 Analyse des données - Excel
préparez une « super » tableau avec toutes les données AVANT de faire les graphiques pour une série (ex. Série A) bien identifier les colonnes (unités etc.) copiez le tableau, changez les DO et tous les calculs se fait automatiquement pour la 2e série

39 Analyse des données - Excel

40 Analyse des données - Excel
1 µM = 1 µmole/L volume de réaction = 2 ml = 2 x 10-3 L Alors: µmole CA = µM x 2 x 10-3 L

41 Analyse des données - Excel
= µmoles CA / (0,5 hr X 0,1 ml)

42 Analyse des données - Excel

43 Analyse des données - Excel
Série A Série B

44 Cette semaine nouvelle courbe standard chaque équipe analyse ses propres résultats analyse des résultats (graphiques MM) avec GraphPad en fin de journée (fichier à Will) rapport à remettre dans 2 semaines