TP master 1 Transfection

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1 TP master 1 Transfection

2 (activité enzymatique)
La transfection des cellules eucaryotes Définition et Principe Transfert de gènes (ADNc) codant pour une protéine dans une cellule = protéine exogène Transfection  Infection (méthode virale) Surexpression de cette protéine grâce à la machinerie cellulaire (transcription/traduction) (1) Etude à partir de lysat protéique (activité enzymatique) ADN protéine exogène ARN (2) Etude in situ ribosomes Une cellule eucaryote

3 Utilisation de particules virales
Techniques Réactifs chimiques - Calcium phosphate - DEAE-dextran - Liposomes artificiels Méthodes physiques - Microinjection directe (dans la cellule ou le noyau) : animaux transgéniques - Electroporation (perturbation de la membrane par un choc électrique) - Propulsion de microprojectiles contenant de l’ADN (in vivo) : plantes Utilisation de particules virales - Rétrovirus - Adénovirus - Particules virales non infectieuses

4 Réactifs chimiques DEAE-dextran 1965 par Vaheri et Pagano
Technique classique, in vitro DEAE-dextran = polymère cationique Association avec les acides nucléiques chargés négativement Endocytose cytoplasme noyau

5 Réactifs chimiques Calcium phosphate 1973 par Graham et van der Eb
Technique classique et bon marché, in vitro Mise en contact de l’ADN avec du chlorure de calcium dans un tampon phosphate Formation d’un précipité entre le calcium et l’ADN Précipité dans la cellule par endocytose ou phagocytose

6 Liposomes artificiels
Réactifs chimiques Liposomes artificiels 1980 par Fraley et co. Efficacité de transfection , fragments d’ADN , types cellulaires , in vitro et in vivo Liposomes = lipides cationiques (+ lipides neutres) Réaction avec les acides nucléiques chargés négativement Compaction de l’ADN = complexe liposomes-ADN Endocytose cytoplasme noyau

7 ADNc codant pour la protéine
Applications (in vitro) 1. Surexpression de protéines absentes dans un type cellulaire donné : sa fonction - sa localisation in situ - son interaction avec d’autres protéines de la cellule ou une autre protéine transfectée (co-transfection avec 2 plasmides) Etude de l’activité d’un promoteur et sa régulation in situ Elaborer une lignée cellulaire immortelle protéine exogène = Antigène T du virus SV40 - … Promoteur du vecteur ADNc codant pour la protéine Promoteur à étudier Gène rapporteur Promoteur du vecteur ADNc codant pour l’Ag T 2. Modifier un gène existant / inhiber l’expression d’un gène existant

8 Etude in situ Surexpression de protéines : Mise en évidence ribosomes
ARN protéine exogène ADN Etude in situ Transfection d’un ADNc codant pour une protéine non modifiée - Détection par immunocytochimie ou par Western blot Transfection d’une construction possédant l’ADNc d’intérêt et une étiquette (« tag ») = Protéine de fusion - GFP (Green Fluorescent Protein) - HA, flag, c-myc … (anticorps) ADNc tag protéine de fusion

9 Etude de l’activité d’un promoteur : Mise en évidence
gène rapporteur galactosidase  lysat protéique activité enzymatique b galactosidase Mesure quantitative ADN protéine exogène ARN in situ galactosidase ribosomes b-galactosidase (spectrophotomètre) Luciférase (luminescence) Effet de facteurs endogènes (facteurs de transcription) Effet de facteurs exogènes sur l’activité du promoteur - facteurs de croissance ajoutés dans le milieu de culture - transfection avec une 2ème construction codant pour une protéine pouvant réguler le promoteur étudié = co-transfection

10 Préparation de l’ADN à transfecter
Réalisation de constructions plasmidiques : vecteur + ADNc/promoteur-gène rapporteur ETUDE catégorie de vecteurs à utiliser Vecteur commum d’expression Plasmide GFPtag Plasmide activité promotrice

11 Vecteur commum d’expression
Promega

12 Plasmide GFPtag ou étiquette GFP
Promega

13 Plasmide permettant d’étudier l’activité
d’un site spécifique d’un promoteur Clontech

14 Transfection transitoire
Deux approches Transfection transitoire Analyse de la transfection à h Perte du plasmide en quelques jours Transfection stable Transfection à long terme L’ADN est généralement intégré au niveau chromosomique Isolation des clones cellulaires par dilutions limites (clonage cellulaire) Criblage par résistance à un antibiotique des clones possédant l’ADN transfecté (néomycine, hygromycine, …) - 3-4 semaines

15 Technique des liposomes
Travaux pratiques de Master BCPP BUT : Transfecter des cellules COS avec des constructions plasmidiques contenant différents ADNc Technique des liposomes Plasmide 1 Plasmide 2 Plasmide 3 Protéine X-GFP Protéine Z-HA b galactosidase Réaction enzymatique colorimétrique Fluorescence directe Immunocytofluorescence

16 Plasmide 1 Protéine X-GFP Fluorescence directe (vert) ADN * X-GFP

17 * * (2) (1) Z-HA Immunocytofluorescence Plasmide 2 ADN Protéine Z-HA
Anticorps de souris anti-protéine HA (anticorps primaire) Immunocytofluorescence (2) Anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à la rhodamine (TRITC) (anticorps secondaire) *

18 Rôle de ce type de construction Plasmide 3
Avantages Mise en évidence facile et rapide Mesure quantitative (in situ) : nombre de cellules bleues / population totale (3) Mesure qualitative (dosage colorimétrique : Luciférase) Rôle de ce type de construction (1) Vérifier que le type cellulaire utilisé peut être transfecté (2) Mesurer une efficacité de transfection Plasmide 3 Galactosidase Réaction enzymatique colorimétrique (cellules bleues) Substrat de l’enzyme = X-gal

19 au niveau d’une même cellule
Plasmide 1 + 2 Protéine Z - HA + Protéine X - GFP Localisation de 2 protéines au niveau d’une même cellule Besoin de 2 fluorochomes

20 Mise en évidence de la présence d’une cellule
Marqueurs généraux = La cellule en entière ou des structures particulières Noyaux (PI: iodure de propidium, DAPI, YOYO, …) Filaments d’actine, cytosquelette (rhodamine-phalloïdine) Marqueurs spécifiques du réticulum endoplasmique Marqueurs membranaires