Bio 17685: Biologie moléculaire du gène Cours: Vecteurs viraux en thérapie génique Claude Gravel, Ph.D. Directeur Laboratoire de Transfert de Gènes CRULRG.

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1 Bio 17685: Biologie moléculaire du gène Cours: Vecteurs viraux en thérapie génique Claude Gravel, Ph.D. Directeur Laboratoire de Transfert de Gènes CRULRG www.crulrg.ulaval.ca/pages_perso_chercheurs/gravel_c/

2 1) Qu'est-ce que la thérapie génique: Peut-être définie comme une méthode thérapeutique visant à introduire des acides nucléiques dans des cellules, dans le but d'altérer l'évolution d'une condition médicale ou d'une maladie. N'est encore qu'une technique expérimentale, et n'a pas encore atteint le statut de traitement médical. Toutefois, l'utilisation médicale du transfert de matériel génétique a commencé depuis plusieurs dizaines d'années: vaccination avec virus atténués. Nous ne parlerons ici que de Thérapie génique somatique, i.e. daltérations génétiques n'affectant pas les cellules germinales et donc, non-transmissibles aux générations subséquentes.

3 2) Champs d'applications (pt de vue clinique): Évidemment, aussi de nombreuses applications dans la recherche biologique.

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6 3) Techniques utilisées: Il existe de nombreuses méthodes permettant d'introduire des acides nucléiques dans des cellules. On peut les séparer en deux catégories: Les techniques physico- chimiques et les techniques virales a) Les techniques physico-chimiques: ensemble des méthodes n'impliquant pas l'utilisation de virus, mais pouvant comporter d'autres substances en plus des acides nucléiques. Comprend ADN nu, microinjection, transfection de précipités d'ADN, lipofection, électroporation etc. Sont simples et contournent les risques potentiels (infectieux) associés à lutilisation de virus. Problème majeur: faible efficacité (i.e. en nombre de cellules transduites p/r au nombre de cellules exposées). On ne discutera pas ici. b) Les techniques virales: méthodes utilisant des virus ou des éléments viraux pour faire entrer les acides nucléiques Pour certains virus, l'efficacité peut atteindre 1 événement de transfert par 4 copies de génome viral, par cellule exposée. Toutefois, l'intérêt pour les techniques non- virales demeure très élevé (sécurité, plus simples à construire et à produire industriellement).

7 -Des vecteurs viraux ont été utilisés dans 65-70% des essais cliniques de thérapie génique.

8 4) Choix de la technique et du vecteur viral: Outre les questions de sécurité, le choix de la méthode utilisable dépend de nombreux facteurs; en voici quelques-uns. a) La nature des cellules-cibles, leur nombre, et leur distribution: -Peut-on prélever les cellules et faire le transfert ex-vivo (Ex: cellules hématopoiétiques) puis réimplanter, ou doit-on procéder in vivo (Ex: cellules du système nerveux)? -Les cellules sont-elles regroupées de façon compacte? Peuvent-elles être atteintes par la circulation (ex.: cellules du foie, cellules endothéliales)? -Quelle proportion des cellules doit-on transduire avec succès pour espérer un effet thérapeutique? -Les cellules-cibles prolifèrent-elles? Sont-elles différenciées? Les cellules sont-elles infectables par un type de virus particulier?

9 b) La durée de transfert nécessaire -Le transfert de gènes doit-il être stable? (Ex: correction d'une maladie héréditaire VS protection contre les conséquences d'un accident vasculaire aigu, ou encore destruction de cellules cancéreuses) c) La taille et la nature du matériel à transférer -Quelle est la taille du matériel génétique à transférer? (Certains ADN sont trop longs pour être contenus dans certains génomes viraux) -Le produit actif est-il l'acide nucléique (ex.: ARN antisens, rybozyme), ou un produit de cet acide nucléique (ex: protéine)? -Etc. Etc.

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11 5) Les vecteurs viraux: Les virus sont moléculairement des parasites essentiels, et ne possèdent pas la machinerie métabolique nécessaire à la synthèse des protéines. Leur propagation naturelle dépend donc de l'efficacité de pénétration et d'expression de leur génome, et la pression évolutive en a fait des machines extraordinairement efficaces. Le principe du vecteur viral est simple: a)Introduire dans le génome d'un virus la séquence (p.e. un ADNc) que l'on désire transférer sous contrôle d'un promoteur/enhancer approprié, b) Faire multiplier ce virus "trafiqué" dans des cellules pour obtenir le nombre de virions nécessaire, c)Utiliser ce virus pour infecter les cellules-cibles in vitro et/ou in vivo et y exprimer la séquence désirée. En pratique, il faut tenir compte de certains détails: à peu près tous les virus sont nocifs, et un grand nombre sont mortels, pour les cellules qu'ils infectent. Ceux qui ne le sont pas sont très fréquemment nocifs pour l'organisme multicellulaire infecté (ici l'homme). Pas tous les virus peuvent infecter tous les types cellulaires. De plus, les organismes-hôtes ont développé des mécanismes de contre-attaque, qui mènent souvent à la neutralisation du virus (immunité humorale), et/ou la destruction précoce de la cellule infectée (immunité cellulaire).

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13 De tous les virus connus, seul un petit nombre ont jusqu'ici été utilisés comme vecteurs dans des essais cliniques, et quelques autres sont en cours de développement. Nous ne nous concentrerons ici que sur les candidats les plus avancés. Ceux-ci peuvent être regroupés en: -les rétrovirus de type C (comme ceux de la leucémie de souris) -les rétrovirus de type lentivirus comme HIV, SIV, FIV ou Visna -les grands virus à ADN comme les Adénoviridae, Herpesviridae, les Vaccinia -les petits virus à ADN comme les Papovavirus (virus simien 40), ou le virus associé de l'adénovirus (AAV)

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15 Rétrovirus de type C et vecteurs dérivés A: Caractéristiques du virus: Virus à ARN (le génome à l'intérieur du virion est un double-brin d'ARN) présents chez de nombreuses espèces (pas chez l'homme). Agents tumorigéniques ou leucémiques.

16 Gènes dun rétrovirus murin

17 Cycle de vie dun rétrovirus murin

18 B: Construction du vecteur: Comment manipuler un génome composé d'un double brin d'ARN? Le secret est de manipuler une copie double brin d'ADN du génome viral (p.e. le génome viral sous sa forme intégrée dans le génome-hôte) que l'on clone dans un plasmide bactérien. Ceci est possible du fait qu'une telle copie est infectieuse, i.e. que lintroduction dune copie ADN double-brin d'un génome viral sauvage dans une cellule eukaryote permissive résulte en la production de virus. On va donc enlever les gènes viraux et insérer le gène à transférer, avec au besoin les éléments de contrôle appropriés (i.e. promoteur/enhancer). On doit garder deux éléments essentiels du génome viral: les LTR (rôle essentiel dans l'intégration et la réplication du génome viral), et la séquence Psi – ou séquence dencapsidation -, nécessaire pour permettre le regroupement et l'arrangement des protéines virales autour du génome viral (i.e. la formation du virion).

19 Exemple dun plasmide contenant le « génome » dun vecteur rétroviral

20 Mais si on insère un tel génome dans des cellules eukaryotes, il n'y aura pas de production de virus puisqu'il n'y aura pas production de protéines virales. Ce génome viral est dit défectif. Alors, comment mettre ce génome dans un virion? Comment produire les quantités nécessaires de virus ? Pour cela, il faut insérer ce génome-vecteur dans des cellules produisant les protéines virales (GAG, POL, et ENV). Pour ce faire, on utilise soit des lignées cellulaires modifiées génétiquement dans lesquelles on a préalablement inséré les gènes encodant les protéines virales, ou encore on fait entrer des plasmides encodant les gènes viraux en même temps que lon fait entrer le plasmide encodant le vecteur.

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22 VECTEURS RÉTROVIRAUX DE TYPE C: AVANTAGES ET DÉSAVANTAGES. -Biologie bien connue. Certains peuvent infecter plusieurs espèces dont l'homme. -N'infectent que des cellules en division (ex: infectent pas neurones) -Simplicité du génome -Capacité de cloning limitée à environ 8 Kb (plus gros, génome entre pas dans virion) -Non-lytique (bourgeonnent), donc peu-pas dommageable pour cellule infectée -Mutagénique (par mutation insertionnelle), et possiblement tumorigénique (activation d'oncogène par le LTR) -Facilité de manipulation du vecteur -Les titres (concentrations virales) sont faibles (10 6 UI ou moins par ml), et les virions sont difficiles à concentrer et sont labiles (mais possibilité de pseudotyper avec dautres enveloppe donc celle de VSV, qui élargit le tropisme et permet la concentration à 10 10 ). -Le transfert est permanent (intégration) -Vecteur totalement défectif n'encodant pas de protéines virales (pas immunogénique)

23 Les vecteurs non-pseudotypés sont surtout utilisés ex-vivo, i.e. que les cellules-cibles sont prélevées du patient, sont cultivées et infectées in vitro, puis sont réimplantées chez le patient. Récemment, on a amélioré les titres viraux atteignables en remplacant l'enveloppe des rétrovirus de type C par celle du rétrovirus Vesicular Stomatitis Virus, qui supporte mieux la centrifugation. Cette enveloppe élargit aussi le tropisme à toutes les cellules de mammifère. Toutefois, cette enveloppe est toxique dans les cellules productrices (d'empaquetage), causant des problèmes de production de grandes quantités de vecteur. Exemples d'utilisation de ces vecteurs: Le premier essai de thérapie génique avec un vecteur rétroviral a débuté le 14 septembre 1990 (sous la direction de William French Anderson, au NIH), chez une patiente de 4 ans souffrant d'une maladie génétique extrèmement rare: L'immunodéficience combinée sévère (SCID) (maladie autosomale récessive) découlant d'un manque de l'enzyme adénosine déaminase (ADA). Sans cette enzyme. les lymphocytes meurent et les patients sont sans système immunitaire (enfants-bulle). Le traitement (peu efficace) consiste en l'administration de l'enzyme ADA couplée au polyethylene-glycol pour favoriser sa pénétration dans les cellules.

24 On a construit un vecteur encodant la ADA, et on a régulièrement prélevé des lymphocytes de la patiente, que l'on faisait proliférer quelques jours en culture, que l'on infectait, puis qu'on réadministrait. Cela a bien fonctionné (les lymphocytes survivaient mieux), mais on n'a pas atteint une efficacité thérapeutique (faut continuer le transfert de gènes régulièrement, et continuer le traitement avec ADA- PEG). Les résultats chez d'autres patients varient beaucoup. Parmi les autres maladies présentement ciblées (essais cliniques en cours), on note l'hypercholestérolémie (récepteur LDL dans hépatocytes), l'hémophilie (facteur IX et facteur VIII), les cancers (on transfère dans les cellules du système immunitaire des gènes qui augmentent leur activité anti-tumorale, ou dans les cellules tumorales des gènes augmentant leur sensibilité aux drogues) etc.

25 LENTIVIRUS ET VECTEURS DÉRIVÉS A) Caractéristiques des virus: Les lentivirus sont des rétrovirus (génomes double-brin ARN) plus complexes que les rétrovirus de type C, bien que leur biologie et leur structure générale soient très près de ces derniers. On les trouve chez plusieurs espèces dont le mouton (virus Visna), le chat (VIF), le singe (VIS), et malheureusement l'homme (par exemple les virus HIV-1 et HIV-2 causant le SIDA, ou HTLV-1 causant la paraparésie spastique tropicale). Ce sont des virus lymphotropiques, i.e. qu'ils infectent surtout les cellules du système immunitaire. Pour HIV-1, le récepteur est le CD-4 (un récepteur impliqué dans la réponse immunitaire), présent sur certaines cellules du système immunitaire (surtout lymphocytes). Il y a des co-récepteurs (on en parle pas ici).

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27 B) Vecteurs lentiviraux: Les principes de construction sont les mêmes, et ne seront pas révisés ici. Ce qui nous intéresse, ce sont les avantages et désavantages: -Un problème technique est quil est difficile déviter davoir des séquences homologues entre le vecteur et les séquences codant les gènes viraux en trans : -Le signal dencapsidation fait partie de la séquence codante des GAGs, et doit donc être présent en cis (vecteur) et en trans. -Le signal rre présent sur lARN et auquel se lie la protéine Rev pour permettre la sortie de lARN du noyau doit aussi être présent en cis et en trans

28 VECTEURS LENTIVIRAUX: AVANTAGES ET DÉSAVANTAGES. -Peuvent infecter et intégrer leur génome dans des cellules postmitotiques (GAG matrix, integrase, Vpr). -Capacité de cloning limitée à environ 8 Kb -Le transfert est permanent (intégration). -Mutagénique (par mutation insertionnelle), et possiblement tumorigénique (activation d'oncogène par le LTR). -Vecteur totalement défectif n'encodant pas de protéines virales (pas immunogénique). -Les titres (concentrations virales) sont faibles (10 6 UI ou moins par ml), et les virions sont difficiles à concentrer et sont labiles (mais possible de pseudotyper avec VSV-G). -Recombinaison possible avec des séquences virales endogènes ou par exposition au virus natif. - Récepteur viral est limité à quelques types cellulaires. -Régulation de l'expression est plus complexe (TAT-Rev) et est sensible au type cellulaire infecté. -Construction de lignées d'empaquetage est plus complexe.

29 On peut régler partiellement le problème de la restriction du récepteur en remplacant l'enveloppe par celle de VSV, et aussi accroitre le titre. Le risque de « rescue » par un virus sauvage est une préoccupation majeure. On travaille présentement à modifier des lentivirus provenant d'autres espèces animales (moins de possibilité de recombinaison et de rescue) afin d'en faire des vecteurs utilisables chez l'humain. Une fois réglées les questions de sécurité et de purification à haut titre, sera un vecteur très utile.

30 aMOYENS ET GRANDS VIRUS À ADN: 1) ADÉNOVIRUS A) Caractéristiques du virus: virus communs chez l'homme (+ de 50 sérotypes connus), les mammifères et les oiseaux. Surtout responsables d'infections respiratoires. Jamais tumorigénique chez l'hôte habituel. On trouve aussi régulièrement du virus, par exemple dans les amydales, chez les individus sains. -Le virus a un diamètre d'environ 75 nm. Il ne possède pas d'enveloppe (pas de lipides). Son génome est un ADN linéaire double-brin qui fait environ 36 Kb, et possédant une protéine (la protéine terminale) liée de façon covalente à l'extrémité 5' de chaque brin.

31 Le virus est répliqué et assemblé essentiellement dans le noyau de la cellule infectée. C'est un virus lytique (il tue donc la cellule-hôte), et plusieurs milliers de virus peuvent être produits par une cellule infectée. Le récepteur sur lequel le virus se fixe pour pénétrer dans la cellule-hôte s'appelle le "Coxsackievirus and Adenovirus Receptor" (CAR), une protéine transmembranaire de la famille des immunoglobulines impliquée dans la formation de jonctions étanches intercellulaires. Il existe des co-récepteurs facilitant l'entrée du virus, par exemple certaines intégrines. Le CAR semble présent sur à peu près toutes les cellules des mammifères, mais la quantité par cellule varie énormément entre les différents types cellulaires, ce qui fait varier leur infectabilité.

32 Le génome encode de nombreux produits, générés par épissage extensif d'un nombre plus limité de transcripts primaires. Du point de vue cinétique, les gènes sont regroupés en 2 classes: 1) les gènes précoces (Early), exprimés rapidement après infection, et qui encodent surtout des facteurs de transcription nécessaires à l'expression des 2) gènes tardifs (Late), qui encodent principalement la polymérase et les protéines structurales.

33 B) Construction de vecteurs: Il existe deux stratégies de construction de vecteurs: 1: la construction de virus modifiés, c'est à dire des virus dont le génome a été modifié de facon à diminuer leur toxicité (par exemple en détruisant un ou des gènes nécessaires à la réplication) et à exprimer le gène d'intérêt (par insertion de ce gène et d'éléments de régulation promoteur/enhancer) 2: la construction d'amplicons, c'est à dire d'ADN d'origine non-virale que l'on modifiera de façon à ce qu'il puisse être répliqué par la polymérase d'adénovirus et encapsidé à l'intérieur de virions, ce qui permettra de le faire pénétrer dans les cellules-hôtes par un processus "infectieux". Ces amplicons n'encodent aucun gène viral, ce qui diminue leur toxicité pour la cellule-hôte. 1: virus modifiés: Parce que le virus est lytique, il est nécessaire de modifier le virus de façon à ce qu'il ne se réplique pas dans les cellules de l'hôte. La stratégie la plus utilisée consiste à déléter la région E1 du génome viral, qui encode des gènes essentiels à la réplication virale et à l'expression de la plupart des gènes tardifs.

34 La stratégie est basée sur les faits suivants: 1) L'ADN viral transfecté dans les cellules est infectieux: on peut donc modifier le génome viral, puis le transfecter dans des cellules pour qu'elles produisent du virus. 2) Les virus E1- peuvent se répliquer dans des cellules fournissant les protéines E1 en trans (les plus utilisées sont les cellules HEK 293, des cellules immortalisées de rein embryonnaire humain qui ont été transfectées stablement avec de l'ADN d'adénovirus et qui produisent les protéines encodées par la région E1). Problème: Parce que le génome est gros (36 Kd), il est difficile à manipuler in vitro, et il existe peu de sites de restriction uniques permettant la délétion ou le cloning de fragments d'ADN. Pour pallier à ce problème, on crée des délétions et/ou des insertions dans des petites sous-régions du génome que lon a sous-clonées, puis on réinsère ces régions modifiées dans le génome viral en utilisant le recombinaison homologue dans des bactéries.

35 Laboratoire de Transfert de Gènes

36 Parce qu'il est possible d'obtenir de très hauts titres, les vecteurs adénoviraux peuvent être utilisés pour le transfert de gènes in vivo. Jusqu'ici, tous les essais cliniques ont été conduits avec des vecteurs recombinants défectifs. Bien que l'on ait observé un niveau d'infection et d'expression efficace, il y a développement d'une inflammation locale, suivie d'une perte d'expression. Une grande dose a récemment causée la mort d'un patient lors d'un essai clinique (un état de choc causé par une réaction inflammatoire généralisée). Parmi les essais cliniques, il ya le transfert du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) dans les voies respiratoires de patients atteints de Fibrose kystique, et divers essais reliés au traitement des cellules cancéreuses. Une manipulation exhaustive des gènes viraux, la dérivation de lignées stables permettant la production de virus portant de large délétions, ou d'amplicons, devraient permettre d'améliorer la performance.

37 VECTEURS ADÉNOVIRAUX: AVANTAGES ET DÉSAVANTAGES Virus modifiés: -Peut infecter et exprimer dans des cellules mitotiques ou postmitotiques-Relativement ardu à construire (mais progrès récents permettent la manipulation du génome dans bactéries) -Capacité de cloning limité (environ 8 Kb) -Peut diriger l'expression à long terme (mois) -Encore incertain si une expression permanente peut être obtenue -Le génome n'est pas intégré dans le génome hôte (non-mutagénique) -Expression résiduelle de certains gènes viraux, qui peut varier en fonction du type cellulaire infecté (toxicité) -Pousse à haut titre, et peut facilement être concentré (>10 12 U.I. /ml) -Réponse immunitaire chez l'hôte aux protéines virales pouvant mener à l'élimination des cellules infectées et à un choc toxique -Plusieurs sérotypes humains bénins sont connus, qui sont à peu près sans danger -Une bonne portion de la population est déjà séropositive pour certains sérotypes communs (immunisée contre l'infection) -Peut infecter presque tous les types cellulaires chez de nombreuses espèces -Difficile de cibler une population cellulaire en particulier, très peu efficace pour cellules. hématopoiétiques

38 2: Amplicons: L'amplicon est d'habitude un plasmide dans lequel on a cloné le gène d'intérêt, et une portion du génome du virus contenant le signal d'encapsidation et l'origine de réplication. Si on transfecte un tel plasmide dans des cellules produisant les protéines virales (par exemple des cellules préalablement infectées avec un autre adénovirus, ce plasmide sera répliqué par la polymérase virale, et encapsidé dans des virions. Problèmes: Les protéines virales étant toxiques, on na pas de lignée dencapsidation comme pour les rétrovirus. Faut donc faire entrer lADN encodant les gènes viraux en même temps que lADN du vecteur, mais sans que lADN contenant les gènes viraux ne soit encapsidé. Solutions: -Au lieu d'utiliser un virus comme helper, transfecter l'ADN viral en plusieurs fragments après délétion de la séquence dencapsidation

39 AVANTAGES -DÉSAVANTAGES Amplicons: -Grande capacité de cloning (38 Kb) -Souvent difficile de se débarasser complètement du virus helper (mais progrès récents ont beaucoup diminué ce problème) -Une certaine facilité de construction -Nécessité d'utiliser la transfection mène à des titres beaucoup moins élevés, et l'on doit concentrer. -Pas de protéines virales produites (basse toxicité) -Difficile de faire le "scale up" pour production médicale parce que l'on doit toujours transfecter des cellules -Stabilité d'expression incertaine

40 VIRUS ASSOCIÉ À L'ADÉNOVIRUS (AAV) A)Caractéristiques du virus Petit virus (parvovirus) à ADN non-autonome, i.e. que ne possédant pas de gène encodant une polymérase à ADN, il requiert la présence d'un autre virus pour la réplication de son génome (le plus souvent Adénovirus, d'où son nom, mais peut aussi se répliquer dans des cellules infectées par Herpes). Il n'est pas associé à aucune maladie, et une bonne partie de la population humaine est déjà séropositive. Le génome du est un ADN simple brin linéaire de 4.7 Kb (les virions contenant le brin positif ou le brin négatif sont tous deux infectieux) n'encodant que deux gènes (rep et cap), flanqués par une région répétée terminale (145 pb). Rep et cap encodent plusieurs protéines produites par épissage. Les premières jouent un rôle dans la réplication et l'intégration, les deuxièmes sont les protéines de la capside (pas d'enveloppe). Chez l'humain, le virus s'intègre dans le génome des cellules infectées, dans une région particulière du chromosome 19. Cette intégration préférentielle est contrôlée par le gène rep. Les récepteurs et co-récepteurs de lAAV-2 (de loin le plus utilisé) comprennent heparan sulfate proteoglycan (comme HSV-1), le récepteur du FGF-1 et des intégrines (p.e. alphaV beta3 et beta5). Le récepteur de AAV-5 est le récepteur du PDGF, et aussi certaines intégrines.

41 a B) Construction de vecteurs: -Un ADN double-brin du génome est infectieux (si transfecté dans des cellules infectées par un helper virus) -L'origine de réplication de l'ADN et le signal d'encapsidation sont localisés dans les séquences terminales répétées. -On clone le gène à transférer entre les séquences répétées terminales, on cotransfecte avec un autre plasmide encodant les gènes rep et cap, et on infecte ces cellules avec un adénovirus, ou on transfecte les quelques gènes dadénovirus requis.

42 VECTEURS DÉRIVÉS DU VIRUS ASSOCIÉ À L'ADÉNOVIRUS AVANTAGES DÉSAVANTAGES -Capacité de cloning très limitée (4.5 Kb) -Peut infecter et intégrer son génome dans des cellules mitotiques et postmitotiques -S'intègre au hasard en l'absence du gène rep (potentiel mutagénique) -Le vecteur n'encode aucun gène viral -L'efficacité d'intégration du génome dans cellules postmitotiques en l'absence de rep varie beaucoup selon le type cellulaire -Vecteur sécuritaire (même virus natif semble sans grand danger) -Titres relativement modestes (10 6 à 10 8 U.I/ml), mais progrès récents dans la concentration du virus permettent >10 10. -Difficile de faire le scale up à cause du besoin de transfecter les cellules. -La présence d'un helper virus est problématique, mais peut maintenant être contournée. La construction de lignées d'encapsidation s'est avérée très difficile, mais progresse. -Lenteur de la synthèse du 2ème brin dans cellules postmitotiques cause un délai dans lexpression du transgène.

43 AUTRES VECTEURS VIRAUX EN DÉVELOPPEMENT: Plusieurs autres virus possèdent des propriétés intéressantes, par exemple en termes de types cellulaires ciblés, en capacité de cloning etc. Par exemple, le poliovirus ou les foamy virus montrent un tropisme pour les cellules du système nerveux, et constituent donc des candidats intéressants pour le transfert de gènes dans le système nerveux. Le virus Epstein-Barr et les papilloma virus montrent un excellent tropisme pour les cellules hématopoiétiques et les cellules mucosales respectivement, et possèdent des fonctions de réplication épisomale. CONCLUSIONS Jusqu'à présent, aucun système de transfert de gènes viral ou non-viral n'a démontré une combinaison de sécurité et d'efficacité suffisante pour justifier son utilisation dans la pratique médicale courante. De plus, il faut comprendre que l'utilisation des techniques de transfert virales sont associées à des coûts de production astronomiques, et que ces coûts joueront un rôle dans le type de vecteur, et surtout dans le type de maladies ou de conditions médicales, qui seront ciblées. -Il serait bien entendu idéal de pouvoir disposer de techniques de transfert de gènes qui n'impliquent pas d'utilisation de virus, à la fois pour des raisons de sécurité, et pour des questions de facilité d'utilisation et de production. Des progrès constants sont faits dans ce domaine. Par exemple, on travaille de plus en plus à la conception de "virus" (ou plutôt de virions) synthétiques, basées sur les mécanismes qui permettent aux virus de livrer si efficacement leur contenu génétique dans les cellules (ligands de protéines membranaires à la surface du virion, mécanisme de rupture des endosomes, mécanisme de transport nucléaire des acides nucléiques etc.).

44 -Bien que la tendance des dernières années a été d'essayer de vider les vecteurs viraux de leur contenu génétique et de leurs protéines, il est important de réaliser que le succès des virus dans le transfert de matériel génétique est justement le fruit d'une forte pression de l'évolution (il ne faut pas oublier que ce sont des parasites essentiels), et que les gènes qu'ils encodent sont responsables de cette efficacité. Par exemple, les virus capables d'infection latente sous forme épisomale dans des cellules postmitotiques comme les Herpes (HSV-1 et Epstein-Barr) ont de gros génomes, justement parce qu'un tel "comportement" demande l'action concertée de nombreuses protéines qui doivent être exprimées temporellement et quantitativement de façon précisément régulée. Il est donc plus que probable que l'élimination de ces gènes dans des vecteurs élimine aussi ces propriétés désirables. Plusieurs virus ont aussi développés des fonctions leur permettant d'échapper au système immunitaire, et de prévenir l'enclenchement de la mort cellulaire programmée (programme d'auto-suicide) qui se produit souvent dans des cellules supportant la réplication des génomes viraux. Ces fonctions pourraient être utiles dans des vecteurs. Il apparait de plus en plus clair que le design d'un vecteur idéal de transfert de gènes unique et dusage universel est une chimère. La diversité des tâches à accomplir, des processus pathologiques ciblés, des organes et des types cellulaires visés font que l'on aura à développer un grand nombre de vecteurs différents, chacun adapté au système visé. Pour ce faire, l'étude de la biologie des virus fournit constamment des éléments cruciaux pour le désign de ces vecteurs.

45 Un domaine de recherche très actif est celui de la modification du tropisme viral, permettant délargir, ou encore de cibler, les divers types cellulaires infectables. Parmi les approches utilisées, on compte -le pseudotypage des rétrovirus à laide de protéines denveloppe dautres virus (ex: virus de la rage pour permettre le transport rétrograde dans les neurones), -la modification des protéines de lenveloppe ou de la capside: - en les modifiant en protéines chimériques comportant un domaine ligand pour un récepteur particulier présent sur les cellules-cibles (e.g: fusion avec nerve growth factor (NGF) pour infection des cellules exprimant TrkA), - en les modifiant en protéines chimériques comportant un domaine encodant pour la région variable dun anticorps spécifique, permettant lattachement du vecteur à lantigène reconnu par lanticorps

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