TD4.

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1 TD4

2 La culture cellulaire

3 pour étudier Le processus et le déclenchement du vieillissement
À quoi servent les cultures de cellules? Le processus et le déclenchement du vieillissement La biologie et la biochimie cellulaires de base, pour étudier les interactions entre les cellules et les agents induisant des maladies, les effets des médicaments sur les cellules,

4 À quoi servent les cultures de cellules?
La cellule comme usine de production l'utilisation de cellules en remplacement de tissus et d'organes (greffes d’organes).

5 Recherche sur le cancer
Les cellules normales et les cellules cancéreuses pouvant toutes deux être cultivées.

6 À quoi servent les cultures de cellules?
Virologie la réplication de virus dans les cultures cellulaires (à la place des animaux) pour les utiliser dans la production de vaccins.

7 À quoi servent les cultures de cellules?
trois domaines se sont montrés plus intéressants: La cellule comme usine de production la production à grande échelle de cellules génétiquement modifiées pour produire des protéines présentant une valeur médicale ou commerciale. (les anticorps monoclonaux, l'insuline, les hormones, etc.)

8 Division cellulaire

9 des organites cellulaires Division des chromosomes
Division cellulaire Cytodierese Cytokinèse Division du cytoplasme et des organites cellulaires Division des chromosomes

10 La division cellulaire est le processus fondamental par lequel une cellule-mère donne deux cellules-filles identiques c c c

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12 Les phases du cycle de division cellulaire
Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités La phase M comporte des phases décrites essentiellement sur la base de la morphologie des chromosomes et de l’enveloppe nucléaire, phases décrites il y a plus de cent ans : correspond à la fin de condensation des chromosomes, rupture de l’enveloppe nucléaire 1 la prophase G1 S S est la période de formation du fuseau et du début d’alignement des chromosomes 2 La prométaphase G2 G2 G2 est la phase d’alignement des chromosomes dans le fuseau, à équidistance des pôles 3 la métaphase M M M 4 l’anaphase voit la disjonction des chromosomes est une période caractérisée par le mouvement des chromosomes vers les pôles, la disparition du fuseau, la décondensation des chromosomes et le début de la cytokinèse. 5 la télophase

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15 La culture cellulaire

16 C’est le maintien en dehors de l'organisme, des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser in-vitro et d'exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques

17 Principe de la culture:
on prend des cellules, des tissus ou des fragments d'organes sur un être vivant (animal ou végétal) ou des cellules naturellement isolées dans la nature telles que les bactéries et on les place dans un milieu favorable à leur survie.

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19 Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
Introduction Différentes sources Insectes Poissons Mammifères Humains

20 Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études
leur placement ultérieur dans un environnement artificiel le prélèvement de cellules, tissus ou organes d'un animal ou d'une plante récipients de cultures appropriés contenant un milieu liquide ou semi-solide qui apporte les nutriments essentiels à la survie et à la croissance.

21 Mise en culture La culture cellulaire est obtenue après le maintien en vie de cellules plus de 24 heures dans un milieu de culture artificielle. On met en évidence deux types de cultures

22 Mise en culture cultures organotypiques cultures histiotypiques

23 Les cultures organotypiques 
sont soumises à un maintien de la différentiation morphologique et fonctionnelle. Ces fragments d’organes ou tissus sont appelés des explants. Les cultures histiotypiques  correspondent à une multiplication active mais sans maintien de l’organisation.

24 Toutefois, dans la pratique, cet objectif n'est jamais atteint, essentiellement parce que la composition de l'environnement habituel des cellules n'est pas connue avec précision, il ne peut donc qu'être approché.

25 Les techniques d'obtention des cellules: On distingue 2 types de cellules:

26 Les cellules libres et circulantes comme les cellules du sang
Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et centrifugation.

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28 Les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu.
Les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en œuvre de techniques plus originales qui peuvent être divisées en 2 groupes: la méthode par dissection et la méthode par digestion enzymatique.

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30 La méthode par dissection: Cette méthode est la plus ancienne
La méthode par dissection: Cette méthode est la plus ancienne. Elle a permis aux précurseurs de la culture de tissu d'obtenir les premières cellules in-vitro. La méthode de dissection consiste à couper en fragment d'environ 1 à 4 mm3  le tissu que l'on réduit encore à l'aide de pince. Ces fragments sont ensuite placés dans un flacon de culture contenant un milieu nutritif.  Les cellules vont migrer à partir des différents fragments puis se multiplier. Cette méthode s'appelle également la méthode des explants.

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32 Les avantages et les inconvénients de ces méthodes.
La méthode par dissection est souvent utilisé quand le tissu à mettre en culture est très petit. L'obtention nécessaire pour avoir des couches cellulaires confluentes est relativement long (environ 30 jours).

33 La méthode par digestion enzymatique:
Les enzymes utilisées sont des enzymes protéolytiques qui digèrent la trame protéique qui entoure les cellules. on utilise souvent la trypsine à une concentration de 0,5 à 2,5 g/l dans une solution saline. Les avantages et les inconvénients de ces méthodes. La méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode.

34 MILIEU DES CULTURES

35 Température 37°C permissivité faible pH 7.2-7.5
Système tampon: HCO3- avec CO2 atmosphérique (5-10%) Indicateur coloré: Rouge de Phénol Lumière visible à éviter

36 Les cultures en milieu liquide
•Le contenant de la culture est un flacon. Les cellules sont ensemencées dans un milieu liquide En suspension dans ce milieu, elles peuvent croître librement jusqu'à épuisement des éléments nutritifs.

37 Les cultures sur support solide
•Cas plus fréquent chez les mammifères et d'une manière générale chez les animaux. •Le fond d'une boite de pétri ou des puits est recouvert d'un support qui permettra aux cellules de s'accrocher.

38 Les cultures sur support solide
•Les cellules sont déposées à la surface de ce support, puis elles seront recouvertes d'un milieu nutritif, naturellement liquide. •Le support peut être très varié. Il peut s'agir simplement de gélatine pour les plus simples, jusqu'a des milieux très complexes contenant des protéines et des facteurs de croissance.

39 Contaminations Contaminants biologiques Bactéries Levures/moisissures Virus Contaminants chimiques Endotoxines Qualité du plastique Reste de détergent Trace d’aluminium Résidus désinfectants

40 Chambres à culture

41 Chambres à culture

42 Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu.
Différents types Culture primaire Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC).

43 Différents types Culture secondaire
Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire «indifférencié» (Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de Cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement). Peut être cultivé en suspension. Durée de vie limitée (30-50 divisions).

44 Lignage cellulaire: Possibilité d’étudier la spécification de types cellulaires au niveau cellulaire dans un contexte embryonnaire (un peu à la frontière entre cultures cellulaires et embryologie…) Modèle ascidies= modèle phylogénétiquement proche des vertébrés+modèle « simple » qui autorise études fonctionnelles poussées. Lignage cellulaire: Possibilité d’étudier la spécification de types cellulaires au niveau cellulaire dans un contexte embryonnaire (un peu à la frontière entre cultures cellulaires et embryologie…) Modèle ascidies= modèle phylogénétiquement proche des vertébrés+modèle « simple » qui autorise études fonctionnelles poussées.

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46 Le lignage cellulaire neural notochorde Lignage cellulaire:
Possibilité d’étudier la spécification de types cellulaires au niveau cellulaire dans un contexte embryonnaire (un peu à la frontière entre cultures cellulaires et embryologie…) Modèle ascidies= modèle phylogénétiquement proche des vertébrés+modèle « simple » qui autorise études fonctionnelles poussées. neural notochorde

47 Différents types Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.

48 Cellules nerveuses Cellules Hela
(cellules immortalisées dérivées de cellules d’un cancer cervical) Cellules nerveuses  les cellules Hela sont les cellules les plus largement utilisés en biologie cellulaire. prises d'une dame africaine appelée Henrietta Lacks en 1951 et envoyé le tour du monde sans son consentement. Ce sont les lignes mêmes cellules qui ont mené à la découverte du vaccin contre la polio.

49 La dynamique cellulaire:
On cherche à observer une évolution (par exemple la localisation d’une protéine en fonction du temps) Il faut donc que la cellule soit vivante! On va insérer dans la cellule un plasmide.

50 Le plasmide est un ADN circulaire contenant le gène codant pour la protéine que l’on veut observer couplé à un gène codant pour une protéine naturellement fluorescente La cellule va incorporer le plasmide dans son ADN et va transcrire puis traduire la protéine qui sera fluorescente.

51 Liposomes • vésicule artificielle à membrane lipidique • Se forme spontanément en milieu aqueux • Pour transfection les lipides = ceux rencontrés dans les membranes plasmiques

52 Electroporation (1982 par Wong)
Microinjection: +Efficacité élevée - Difficile à mettre en œuvre qq centaines de cellules peuvent être traitées/ exp Electroporation (1982 par Wong) +Efficace pour la plupart des types cellulaires +Rendement important pour transfection transitoire ou stable +Facile à mettre en œuvre Transfection par vecteurs viraux : Les rétrovirus (ARN monocaténaire)

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