COPROLOGIE Cycle biologique d’Entamoeba histolytica

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1 COPROLOGIE Cycle biologique d’Entamoeba histolytica
Dessins de Van N’GUYEN-ANH In Dictionnaire de Parasitologie de P.BOUREE

2 Diagnostic parasitologique
Intérêt: Diagnostic individuel Enquête épidémiologique Difficultés et limites (Diagnostic d’orientation)

3 Diagnostic parasitologique
Milieux biologiques Selles (coprologie) Kopros Urines Sang Autres Peau, LBA, MO, Muscles…. Ectoparasites

4 Parmi tous les périls, le moindre n’est pas le fécal
Gandhi, activiste indépendantiste indien, estimait que le développement des sanitaires était un objectif plus important que l'indépendance.

5 L'accès aux toilettes, enjeu mondial de développement
En Afrique, la moitié des lits d'hôpital sont occupés par des patients souffrant de maladies véhiculées par les matières fécales. Compte rendu L'accès aux toilettes, enjeu mondial de développement LE MONDE | | 15h05  •  Mis à jour le | 15h05 Pour réduire la pauvreté dans le monde et améliorer la santé des déshérités, la méthode la plus simple est de construire des toilettes. C'est la conclusion à laquelle est parvenu le Réseau international sur l'eau, l'environnement et la santé (Inweh), branche canadienne de l'Université des Nations unies. Dans un rapport rendu public le 20 octobre, ce groupe de réflexion recommande aux gouvernements une approche plus coordonnée et intégrée des questions d'approvisionnement en eau potable et d'accès à des sanitaires fonctionnels. Les chiffres font frémir : environ 2,5 milliards de personnes - plus d'un tiers de l'humanité - utilisent des latrines qui n'offrent pas de garantie contre le développement de maladies liées aux matières fécales. Et 1,2 milliard n'ont d'autre ressource que de déféquer dans la nature, selon des données collectées par l'Organisation mondiale de la santé et l'Unicef. Ces personnes passent une demi-heure en moyenne chaque jour à faire la queue dans des installations publiques ou pour trouver un endroit isolé. Soit deux jours ouvrés par mois. L'impact sanitaire est considérable. Les maladies diarrhéiques tuent 1,8 million de personnes chaque année. On estime que 88 % de ces affections ont pour origine un manque d'hygiène et d'accès à des sanitaires sûrs. Les enfants, dont meurent chaque jour, paient le plus lourd tribut. En Afrique subsaharienne, la moitié des lits d'hôpital sont occupés par des patients souffrant de maladies véhiculées par les matières fécales. Dans le monde, 200 millions de tonnes d'excréments humains finissent dans des rivières chaque année, contaminant les eaux de surface, voire les nappes phréatiques, avec leur lot de bactéries, virus et autres parasites. Cet enjeu sanitaire figure rarement au premier plan de l'agenda international. "La question reste taboue, reconnaît Zafar Adeel, directeur de l'Inweh. Les politiques hésitent à aborder ces problèmes dans leurs discours. Ce n'est pas "poli"." Les Nations unies ont surmonté cette aversion a été déclarée année mondiale de l'assainissement. Et le développement des toilettes était l'un des objectifs du millénaire, définis en 2000 : diminuer par deux le nombre de personnes n'ayant pas accès à des sanitaires d'ici à 2015. En Occident, "les systèmes de distribution d'eau sont souvent anciens. Seront-ils capables d'encaisser des événements climatiques extrêmes qui accompagneront le réchauffement de la planète ?, s'interroge-t-il. Il faut s'en soucier. Et le plus tôt sera le mieux."

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7 COPROLOGIE Selles Parasites recherchés : kystes, œufs, larves, adultes
Prélèvement Mesure des éléments parasitaires Techniques de concentration et techniques particulières

8 Diagnostic coprologique
Entamoeba hartmanni Endolimax Giardia Chilomastix Iodamoeba Entamoeba coli Entamoeba histolytica Douve de Chine Petite Douve segmentée embryonnée Bothriocéphale Taenia Hymenolepis nana Hymenolepis diminuta Ascaris typique atypique Trichocéphale Oxyure Ankylostome Dipylidium Grande Douve Schistosoma intercalatum Schistosoma mansoni Schistosoma japonicum

9 10µm Entamoeba coli Entamoeba histolytica Entamoeba hartmanni Endolimax Giardia Chilomastix Iodamoeba 50µm Douve de Chine Petite Douve Bothriocéphale Taenia Hymenolepis nana Hymenolepis diminuta 50µm Ascaris Trichocéphale Oxyure Ankylostome Dipylidium 100µm Grande Douve Schistosoma intercalatum Schistosoma mansoni Schistosoma japonicum

10 Prélèvement dysenterie amibienne

11 Etalonnage du Microscope
Mesure des éléments parasitaires Etalonnage du Microscope Micromètre oculaire

12 Etalonnage du Microscope
Déterminer la longueur couverte en m par une division du micromètre oculaire          Remplacer l’oculaire normal par l’oculaire micrométrique.     Disposer sur la platine du microscope le micromètre-objet.        Etablir la mise au point des 2 échelles et faire coïncider les « O » des deux échelles.         On repère une division du micromètre oculaire qui se superpose exactement à une division du micromètre-objet ; ces deux divisions doivent être recherchées le plus loin possible du « O », de façon à obtenir une meilleure précision. On peut ainsi en déduire la longueur de chaque division du micromètre oculaire. Effectuer l’opération pour les deux objectifs x 10 et x 40. Micromètre objet Micromètre oculaire Exemple : 18 divisions du micromètre oculaire couvrent 300 m  1 division couvre donc 16,66 m 

13 Micromètre oculaire

14 Techniques de concentration Méthode diphasique: acéto-acétique / éther
Méthode par flottation : réactif iodo-mercurique

15 Méthode diphasique: acéto-acétique / éther
1- Dilution homogène selles + acéto-acétique - Pré dilution : 1 goutte pour examen direct - Poursuivre la dilution - Laisser sédimenter 10 à 30 sec les gros débris Examen Direct 2- Émulsionner : oblitérer l’orifice avec le pouce et agiter vivement dilution fécale + éther éther émulsion dilution fécale

16 3- Centrifuger 3 min à 2500 trs/min : 4 couches se superposent
Phase éthérée Débris Phase aqueuse Culot d’enrichissement : PARASITES 4- Isolement du culot de centrifugation - Décoller l’anneau de débris avec les mors d’une pince - Eliminer d’un geste sec les 2 phases liquides et l’anneau Remettre rapidement le tube à l’horizontale Passer un tampon de coton sur les parois internes du tube - Agiter le tube pour remettre en suspension et prélever à la pipette Pasteur

17 Méthode par flottation : réactif iodo-mercurique
Technique de JANECKSO et URBANYI modifiée 1- Dilution homogène Selles + Eau distillée 2 - Tamiser 3 - Centrifuger 2 à 3 min à 3000 trs/min Eliminer la phase aqueuse Diluer le culot avec le réactif iodomercurique 4 - Centrifuger 2 min à 2000 trs/min Prélever 4 à 5 gouttes du film superficiel avec une anse métallique

18 Technique de KATO et MIURA
(éclaircissement par la glycérine)

19 Frottis épais de KATO et MIURA
NUMERATION DES ŒUFS Cette technique permet d’apprécier l’intensité d’une infestation (Ankylostomes), de juger de l’efficacité d’une thérapeutique Frottis épais de KATO et MIURA Principe : technique de décoloration des selles qui permet de distinguer les œufs de parasites dans une préparation des selles rendue translucide. - Glycérine ml - Eau distillée ml - Solution de vert malachite à 3 % ml Bandes de cellophane adhésive de 20 x 30 mm immergées dans la solution de glycérine pendant 24 heures. Technique: Sur une lame porte-objet, déposer 50 mg de selles, recouvrir par une des bandes de cellophane imprégnée, presser à l’aide d’un bouchon de caoutchouc pour répartir régulièrement la selle; laisser éclaircir une heure à température ambiante. Examiner rapidement car un sur-éclaircissement risquerait de faire passer inaperçu certains œufs (Ankylostomes, Schistosomes). Les résultats sont rendus en nombre d’œufs par gramme de selles.

20 techniques particulières
sol humide t°> 25° oeuf larve larve strongyloïde infestante

21 Strongles et Ankylostomes
Coproculture Strongles et Ankylostomes Méthode en boite de Pétri Lames + papier filtre Selles Eau Incubation 25 à 28 °C Ajouter de l’eau chaque jour Strongles : larve rhabditoide 2 jours larve strongyloide Ankylostomes :œuf heures larve rhabditoide jours larve strongyloide !!! Larves strongyloides infestantes par voie transcutanée

22 techniques particulières
Méthode de BAERMANN et LEE concentration des larves des Strongles sol humide t° > 20 larve rhabditoïde larve strongyloïde infestante Strongyloides stercoralis

23 Méthode de BAERMANN et LEE
Méthode biologique de concentration des larves des Strongles selles tamis + gaze eau tiède raccord caoutchouc + pince pipette larve strongyloïde Les larves se collectent dans la pipette en 2 à 3 heures . Soutirer 10 ml de liquide; centrifuger lentement; examiner le culot.

24 Enterobius vermicularis
Scotch test Enterobius vermicularis Taenia saginata

25 Culture d’amibes Prélèvement multiplication en 24 à 48 heures à 37°C
Sérum de RINGER Etalement de selles Etalement de selles Sérum de cheval coagulé Sérum de cheval coagulé Prélèvement multiplication en 24 à 48 heures à 37°C

26 Examen d’une préparation microscopique
Recherche et identification d’œufs d’Helminthes et de kystes de Protozoaires Examen systématique entre lame et lamelle de la préparation selon le schéma suivant 1 – parcourir la lamelle à l’objectif x 10; chaque élément intéressant est observé puis mesuré à l' objectif x 40 les œufs d’Helminthes sont ainsi identifiés. l’identification des kystes de Protozoaires s’effectue ensuite à l’objectif x 100 à immersion; elle peut être facilitée par la coloration des structures nucléaires par la coloration Violet cristal – Fuchsine basique .

27 PROTOZOAIRES

28 FORMES VEGETATIVES D’AMIBES
Taille Pseudopodes Mobilité Cytoplasme Noyaux Entamoeba coli 20 à 30µm Courts, larges,lents. Plusieurs à la fois. + Endoplasme grossièrement granuleux. Grosses vacuoles bourréesd’inclusions. Visibles à l’état frais. Chromatine irrégulière. Caryosome épais, en général excentré Entamoeba histolytica 12 à 25µm jusqu’à 40 Longs, hyalins. Un seul à la fois. ++++ Endoplasme finement granuleux. Vacuoles petites et peu visibles. Hématies Difficiles à voir à l’état frais.Chromatine régulière. Caryosome central et punctiforme. Entamoeba histolytica / dispar 12 à 15 µm jusqu’à 25 Effilés, hyalins, rapides +++ Endoplasme finement granuleux. Ectoplasme hyalin et transparent. Entamoeba hartmanni 4 à 10µm Allongés, hyalins. ++ Ectoplasme et endoplasme peu distincts. Petites vacuoles. Difficile à voir à l’état frais.Chromatine épaisse en amas. Caryosome de grande taille, en général central. Endolimax nanus 8 à 10 µm jusqu’à 15 Arrondis, en boule, clairs. Non visibles à l’état frais. Caryosome de grande taille, ovalaire, excentré. Iodamoeba butschlii 8 à 15 µm Longs, en doigt de gant, réfringents. Endoplasme et ectoplasme peu différenciés. Vacuoles +++ Inclusions +++ Non visible si vivante; visible si morte. Gras caryosome central, arrondi, entouré de granules.

29 Entamoeba histolytica dispar
KYSTES D’AMIBES Taille Forme Cytoplasme Cristalloïdes Noyaux Entamoeba coli 15 à 20 µm Arrondie Ovalaire Clair, hyalin, réfringent Vacuoles + Difficiles à voir Forme d’aiguille 1 à 8 Chromatine irrégulière Caryosome épais et excentré Entamoeba histolytica dispar 12 à 14 µm Granuleux Vacuoles ++ Présence irrégulière, Forme de saucisse 1 à 4 Chromatine régulière Caryosome central et punctiforme Entamoeba hartmanni 3 à 10µm Vacuoles +++ Trapus, Chromatine épaaisse Caryosome de grande taille Endolimax nanus 8 à 10 µm Ovoïde Rectangulaire Hyalin Néant Caryosome en tâche Iodamoeba butschlii 8 à 15 µm Polymorphe 1 vacuole iodophile Caryosome de grande taille entouré d’un halo claur

30 Rhizopodes Flagellés Entamoeba coli Entamoeba histolytica
Endolimax nanus Entamoeba hartmani Iodamoeba butsclii Flagellés Giardia intestinalis Chilomastix mesnilii

31 Autres PROTOZOAIRES parasites de l’appareil digestif
Rhizopodes: - Amibes - Blastocystis hominis Coccidies: Cryptosporidies coloration d’Henriksen Pohlenz Cyclospora Isospora belli Sarcocystis hominis ( Microsporidies ) coloration de Weber

32 Coloration des Cryptosporidies
Technique d’HENRIKSEN et POHLENZ Etaler sur une lame une goutte de selles liquides ou de culot de concentration Fixer au Méthanol 5 mn puis sécher Colorer par la Fuchsine phéniquée 1 heure Rincer à l’eau du robinet Différencier par H2SO4 à 2% 10 à 20 secondes Contre-colorer au Vert de Malachite à 5% 5 mn Rincer à l’eau du robinet puis sécher Lecture à l’objectif x 100 Les Cryptosporidies prennent une teinte qui varie du rose pâle au rouge vermillon , alors que les levures se colorent en vert.

33 Cryptosporidium sp

34 Cryptosporidium sp

35 Isospora belli

36 HELMINTHES

37 Trématodes (schistosomes)
Schistosoma mansoni Schistosoma intercalatum Schistosoma japonicum

38 Trématodes (douves) Grande Douve Fasciola hépatica
Petite Douve Dicrocoelium dendriticum ( segmentée ) ( embryonnée) Douve de Chine Clonorchis sinensis

39 Diphyllobothrium latum Taenia saginata, T. solium
Cestodes Bothriocéphale Diphyllobothrium latum Ténia Taenia saginata, T. solium Hymenolepis nana Hymenolepis diminuta

40 Taenia saginata Ver entier : 2 à 10 m Segment mûr éliminé isolément

41 Nématodes Crudités Mains sales Eau

42 Ancylostoma duodenale Enterobius vermicularis
Ascaris Ascaris lumbricoides typique atypique Trichocéphale Trichuris trichiura Nématodes Ankylostome Ancylostoma duodenale Necator americanus Oxyure Enterobius vermicularis Dipylidium caninum

43 Ascaris lumbricoïdes

44 femelle 3 à 5 cm mâle Trichuris trichiura

45 Artéfacts

46 Pouvant être confondues avec des kystes ou des œufs
SPORES VEGETALES Pouvant être confondues avec des kystes ou des œufs

47 Pouvant être confondues avec les œufs d’Ascaris
SPORES VEGETALES Pouvant être confondues avec les œufs d’Ascaris Pollen d’artichaut

48 Pouvant être confondues avec des kystes ou des œufs
SPORES de CHAMPIGNONS Pouvant être confondues avec des kystes ou des œufs Spore de morille Spores de bolet de pin Spores de truffe

49 CRISTAUX Charcot Leyden Acides gras Oxalate de calcium

50 ARTEFACTS DIVERS Cellule à amidon Poil végétal Spire vaisseau du bois Cellules palissadiques de légumineuses Œuf d’acarien

51 CHAMPIGNONS levures arthrospores

52 Autres prélèvements

53 Urines - Schistosoma haematobium 150µm
- éperon terminal court dans l’axe de l’œuf - pôle opposé à l’éperon arrondi (parfois présents dans les selles indépendamment de toute souillure par les urines) - Trichomonas vaginalis

54 - Trichomonas vaginalis
Prélèvement vaginal - Trichomonas vaginalis 30µm forme végétative

55 Tubage gastroduodénal - Giardia intestinalis (forme végétative)
- Strongyloïdes stercoralis (larves) - Douves hépatobiliaires (œufs) - Schistosoma japonicum (œufs) LBA ou crachats - Paragonimus westermani (œufs) - 100 µm - opercule aplati rompant le contour ovoïde - Scolex invaginés lors de la rupture d’un kyste hydatique pulmonaire - Strongyloïdes stercoralis (larves) Muscle - larves de Trichinella spiralis

56 Coloration des Microsporidies Technique de WEBER
Réaliser un frottis très mince sur 1 cm2 avec 10 l de selle liquide, sécher Fixer au Méthanol 5 mn puis sécher Colorer au WEBER 90 mn Décolorer dans l’alcool acétique 10 secondes Rincer rapidement dans l’alcool à 90° Déshydrater successivement 1 mn par alcool 95°, alcool absolu, xylène Montage au Depex

57 Microsporidies

58 Microsporidies

59 L B A : Pneumocystis carinii

60 L B A : Pneumocystis carinii