CREATION D’ANIMAUX TRANSGENIQUES PAR MODIFICATION DES SPERMATOZOIDES

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1 CREATION D’ANIMAUX TRANSGENIQUES PAR MODIFICATION DES SPERMATOZOIDES
Yves Demulière Lise Grout Ludovic Simon

2 Création d’animaux transgéniques par modification des spermatozoïdes
Transgenèse par modification des spermatozoïdes : Avantages par rapport aux autres méthodes Incubation avec de l’ADN Electroporation Décondensation du noyau Transgenèse par modification des précurseurs : Transfection et recombinaison homologue Infection virale Application au génie génétique : Espoirs Problèmes éthiques

3 Transgenèse par modification des spermatozoïdes
Avantages par rapport aux autres méthodes:

4 a. Présentation des autres méthodes
Microinjection d’ADN : - introduction d'un gène ou plus d'un autre animal, d'espèce identique ou différente, dans le pronucléus d'un ovocyte fécondé - forte probabilité de ne pas s'intégrer dans un site de l'ADN hôte favorisant son expression Transfert de gènes à l'aide de cellules souches embryonnaires : - recombinaison homologue dans une culture in vitro de cellules ES, intégrées à un embryon au stade blastocyte - animal chimérique - méthode knock-out Transfert de gènes à l'aide de rétrovirus : - vecteurs (en général un plasmide ou un virus), les rétrovirus présentant une facilité à infecter les cellules hôtes - chimères, l’ADN modifié devant être intégré aux cellules germinales pour que le transgène puisse être transmis

5 b. Problèmes avec ces méthodes

6 Problème d’individus chimères Aucun individu mosaïque
seul 1à 20% des individus obtenus en F1 transgéniques Nécessite donc des centaines de poissons et deux générations pour avoir une lignée transgénique Taux d’individu transgénique plus faible en F1 Pas de F2 nécessaire et screening réalisé a moins grande échelle

7 2. Incubation avec de l’ADN
Souris Association facile et stable ADN/membrane externe Etendue à d’autres espèces => ECHEC A grande échelle -> faible taux Gène non intègre, réarrangé et non fonctionnel (mouton : spz lavés)

8 3. Electroporation Poisson zèbre
Choc électrique perméabilisant la membrane Fonctionnel mais pas transmis aux générations suivantes (pas intégré ?) Etendu à d’autres poissons -> pas de lignées transgéniques stables Spz matures ne sont pas de bons véhicules

9 4. Décondensation du noyau :
Xénope Isolation , décondensation, enzymes de restriction, ADN linéarisé Injection dans cytoplasme d’un ovocyte Nb élevé de xénopes transgéniques Multiples copies de séquences Pas de mosaïques Fonctionnalité et transmission à la descendance

10 II. Transgenèse par modification des précurseurs :
Culture et maturation des spz difficiles 1. Transfection et recombinaison homologue: Spermatogonies qqs heures en culture Réimplantation dans testicule d’une autre souris Marquage par LacZ ADN intégré, fonctionnel, transmis ?

11 2. Infection virale : a. In vivo
Injection de lentivirus dans les tubes séminifères Obtention de cellules de Sertoli infecté mais pas de souris transgéniques obtenues après fécondation Injection intracytoplasmique de spermatozoïde préalablement sélectionné par fluorescence Seul succès obtenu jusqu’à présent avec des méthodes non virales

12 b. In vitro : Poisson zèbre Méthode : Résultat :
Transfection avec plasmide codant une protéine d’enveloppe Dissociation des testicules Centrifugation -> récupération de précurseurs Mise en culture sur cellules nourricières Résultat : Intégration des gènes avant différentiation (LacZ) Bon résultats ≈ 5,6% de PS transgéniques hétérozygotes Facteurs influençant les taux d’intégration ? Sensibilité Cellules germinales/cell. Somatiques

13 III. Application au génie génétique : 1. Espoirs :
A propos des souris de labo? Production d’organe humanisé ex porc Aspect économique Ex des saumons ayant reçu le gène d’une hormone de croissance sont vendables deux fois plus tôt en mangeant moins Production de protéine d’intérêt pharmaceutique par certains mammifères Résistance à certaines bactéries Succès chez la souris ( en cours de réalisation pour la vache)

14 2. Les problèmes associés
Production d’individus-médicament Production d’animaux super-résistants Problèmes écologiques associés Problème des résistances bactériennes Problème de l’innocuité pour l’Homme Problème de la conquête de la confiance du consommateur

15 Bibliographie J-M Houdebine Les animaux trangéniques
PNAS, 3 février 2004, Kurita et al Transgenis Zebrafish produced by retroviral infection of in vitro-cultured sperm Vincent Thizeau, Transgenèse animale, les transfert de gènes chez les animaux

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