Les vecteurs Rétroviraux

Présentation au sujet: "Les vecteurs Rétroviraux"— Transcription de la présentation:

1 Les vecteurs Rétroviraux
Jean-Christophe Pagès

2 Les rétrovirus Mammalian C-type Lentivirus Spumavirus Avian C-type
BLV/ HTLV D-type B-type Premiers vecteurs

3

4 Famille : Retroviridæ Genres : Oncorétrovirus Lentivirus...
LTR GAG POL ENV LTR 8 kb

5 Intérêts des rétrovirus comme vecteurs
1. Simplicité 2. Capacité de clonage de 11kb 3. Intégration du gène thérapeutique 4. Expression prolongée 5. Transduction de cellules in vivo 6. Transduction de cellules cyclant peu où différenciées.

6 Contraintes Structure du vecteur & Production…. Évolutions Spécificités du gène thérapeutique Prodrogue Facteur de croissance Replacement métabolique Modificateurs de survie Spécificités du patient et de la pathologie Pathologie en phase terminale Pathologie chronique Adultes Enfants

7 Aspects législatifs et éthiques
CGG: donne un classement de l’OGM CGB: définit les conditions de sortie des patients Agence du médicament (AFSSAPS): Groupe de travail sur la thérapie génique Examen des demandes de protocoles cliniques Donne l’autorisation de l’essai. Seule la thérapie génique somatique est autorisée

8 DÉFINITIONS Transduction: Transfert viral
Tropisme viral: Spécificité de reconnaissance de la cellule cible Déterminant: enveloppe virale Amphotrope Ecotrope Xenotrope Interférence: Impossibilité d ’infecter une cellule exprimant une Protéine d ’enveloppe virale avec un virus exprimant la même enveloppe Pseudotypage: Utilisation d ’une enveloppe hétérologue

9 Cycle des rétrovirus K Kß Expression virale Gène thérapeutique

10 Expression des gènes viraux
LTR LTR MA p12 CA NC PRO RT IN Env Unité transcriptionnelle indépendante: Non Readthrough ou décalage sur knot SD SA Oui

11 Lignée Productrice GAG POL ENV Structure du vecteur???

12 R U5 PBS U3 R R U5 PBS U3 R U3 R U5 PBS U3 R U5 ppt U3 R U5 PBS ppt
TATAA pA U3 R U5 PBS ppt U3 R U5

13 Structure du vecteur: éléments CIS
Éléments pour la RT Éléments pour l’encapsidation Promoteur  PBS ppt Transgène

14 Cellule Productrice Cellule Transduite  LTR 5' LTR 3' LTR 5' LTR 3'
AAA  LTR 5' LTR 3' Cellule Transduite LTR 5' LTR 3' AAA

15 Vecteurs particuliers
Double copie Y PBS ppt Y PBS ppt Vecteurs « propres » LoxP Y PBS ppt Cre Y PBS ppt LoxP Cre LoxP

16 Les formes moléculaires des complexes de préintégration:
Cercles ouverts Cercles fermés: 1 LTR ou 2 LTR

17

18 Sites d’intégration des rétrovirus

19 Éléments critiques Tropisme: Lié à l ’enveloppe (pseudotypage)
Titre viral: Dépendant de la cellule productrice Résistance aux facteurs sériques pour l’in vivo: Liée à l ’enveloppe Dépendante de la cellule Sureté du vecteur: cf fin

20 Ciblage de la cellule à transduire
Enveloppe rétrovirale VRA VRB PRR

21 Composés bispécifiques
Enveloppes recombinantes

22

23 Ciblage par expression
Vecteur d ’expression hépatospécifique: promoteur de la pyruvate kinase LTR L-PKp LDL-R LTR  -3200 -2080 -392 +11 Séquences activatrices Promoteur et éléments de réponse à l'insuline et à l'AMPc

24 A B LDL-R L-PK endogène GAPDH Régulation du promoteur de la L-PK
dans les hépatocytes murins transduits: B Mise en évidence du LDL-R humain après transduction d’hépatocytes murins: Insuline 10-8 M + - Glucose 20 mM Glucagon 10-6 M LDL-R L-PK endogène GAPDH

25 Contrôle de l’expression par un système inductible
TetO2 LTR CMVp Gène thérapeutique CMVp TetR

26 Limites des vecteurs rétroviraux: Cycle cellulaire
Utilisation clinique: In vivo: Non Ex vivo: Cellules hématopoïétiques cf l’essai X-Scid

27 Cellules humaines myogeniques
Transduction de CHQ5b: Cellules humaines myogeniques HIV MLV Myoblastes Myotubes

28 RT MLV HIV NLS PIC NLS PIC MA +/- +/- +/- Ka Kß CA +/- + HIV MLV NC + ? + RT + ? + INT ? + + + AccP + + CellF + +

29

30 Les vecteurs lentiviraux
Famille : Retroviridæ Genre : Lentivirus Sous-espèces: -HIV 1 -HIV 2 -SIV -FIV -BIV -VISNA -CAEV -EIAV

31 GAG ENV POL U3 R U5 Cis acting: Y pptc RRE ppt PBS Gag: MA CA NC p6
Vif Vpr Nef GAG Vpu ENV U3 R U5 POL TAT REV Cis acting: Y pptc RRE ppt PBS Gag: MA CA NC p6 Vif : Dans les cellules non permissives: role dans la maturation des particules Pol: PR RT IN Vpr : Import nucléaire Arret en G2 Transactivation Env: SU TM TAT: Fixe TAR et favorise la processivité de la RNA pol II Vpu: Degradation de CD4 et MHC I Relargage des particules REV: Se fixe sur le RRE - Export des ARN non épissés - Export du messager GAG Nef: Down regulation de CD4 et MHCI

32 GAG POL ENV GAG POL DENV GAG POL ENV GAG POL DENV GAG POL U3 R U5
TAT REV Vif Vpr Vpu Nef Vif GAG POL DENV TAT REV Vpr Vpu Nef CMV InspA Vif GAG POL ENV TAT REV Vpr Vpu Nef CMV InspA GAG POL DENV TAT REV CMV InspA GAG POL CMV InspA RRE

33 Autres vecteurs lentiviraux
EIAV: Non-Primate, 3 genes accessoires tat LTR tat rev rev gag LTR env pol S2 RT RH DU IN SD TAR Y cPPT RRE Pun HIV: Primate, 6 genes accessoires vpr LTR gag pol vpu nef LTR env RT RH IN TAR SD vif tat rev Y cPPT RRE Pun

34 Evolution des provirus recombinants
Cis acting: Y pptc RRE ppt PBS RRE Y PBS ppt RRE Y PBS ppt RSV Vecteur SIN, TAT indépendant RRE Y PBS ppt RSV Vecteur SIN, TAT indépendant WPRE RRE Y PBS ppt RSV Vecteur SIN, TAT indépendant pptc

35 Tropisme des vecteurs lentiviraux
Naturel: Thérapie anti-VIH Pseudotypage: Enveloppe Amphotrope Enveloppe VSV-G

36 Production des vecteurs lentiviraux:
17K 21K Ultracentrifugation a/Titration p24 b/Titration sur cellules (4,5 103 pfu/ng p24) J0 293T p8.91+pHR’+pMD-G J1 Changement de milieu J2-J4 Récolte

37 Lignées productrices stables
Toxicité de Rev: Solution 1: Rev inductible Solution 2: Gag-Pol Rev indépendants Mutagenèse des séquences par wobbling Toxicité de la VSV-G: Promoteur inductible: Tet VSV-G TetO2 CMVp pA TetR

38 Lentivirus et usage des codons
MH WT CO Ala A 13 46 8 Cys C 68 10 70 Leu 3 14 Ser 34 35 55 GC 53 19 65 TG T 32 90 30 CT 26 17 AG G 11 58 TC 5 38 24 Gln 12 21 6 28 CA 88 47 79 TT 2 42 9 7 Arg 18 29 Glu 25 CG GA 75 62 Lys Thr 45 16 37 61 AA 82 72 AC 57 52 Gly 15 GG 50 Phe 80 20 Asn 78 71 Tyr 74 22 Pro TA His CC 48 39 Asp 64 Val 56 4 36 GT Ile 76 AT 92 77 23

39 Gag-Pol Optimisé pour les Codons
pEV53B Rev Rev pA SD Gag Pol CMVp S2 * (Y) cPPT RRE pESYNGP CMVp pA Gag Pol Changement de codons de gag-pol à lexception du critique “frame-shifting” Délétion des homologies de sequence Rev-independant

40 Applications

41 Transduction de cellules hématopoïetiques
Le virus possède un tropisme naturel pour ces cellules Les virus murins nécessitent une activation des cellules souches incompatible avec une prise de greffe sur le long terme.

42

43 Vecteurs EIAV : Expression in Vivo
Rat thalamus 8 jours 24 semaines L’expression prolongée prévient la nécessité de ré-administrations

44 Le FIV vecteur de transfert de gènes

45 Limites des vecteurs lentiviraux
Transduction de cellules arrétées ou de cellules activées: Cellules hématopoïétiques: Sutton et al. J. Virol. 1999 Unutmal et al. J. Exp. Med. 1999 Hépatocytes in vivo: Kay et al. Nat. Med. 2000 Conditions de production: Lignées stables: pas absolument nécessaire Deux essais cliniques en cours.

46 Développements

47 Cib Résultats actuels: In vitro OK En cellules : non
Ciblage des intégrations: Cib Résultats actuels: In vitro OK En cellules : non

48 Organisation de l’ADN nucléaire
Horn & Peterson Science 297:

49 Peu compacte: active Très compacte: inactive
Influence de la structure sur l’expression Peu compacte: active Très compacte: inactive Horn & Peterson Science 297:

50 Les domaines de la chromatine
La chromatine est organisée en domaines Chaque domaine est séparé d’un autre par des isolateurs Les domaines sont des boucles d’environ 50 kb Lors de la mitose les boucles sont contraintes par un complexe protéique

51 Structure d’un complexe isolateur
Gaszner & Felsenfeld (2006) Nat Rev Genet 7:

52 États fonctionnels de la chromatine
Hétérochromatine : Réprimée, pas d’expression. Euchromatine: Inactive, mais potentiellement activable, ADN non transcrit. Active, transcription en cours

53 Utilisation des isolateurs ou « insulateurs »:

54

55 Autres causes d’extinction:
Les modifications épigénétiques: De la chromatine. Profil de méthylation des histones: cellules ES H3K27me/H3K4me Différenciation H3K27me H3K4me Gène réprimé Gène exprimé

56 Méthylation des promoteurs
La méthylation de l’ADN est un mécanisme de répression de l’expression. Les cytosines sont méthylées en position 5 dans les îlots CG: Nucleotide: Sequence: ...CG C5mG...

57 Structure de la LTR de MLV
U3 R U5 TATA Sites de méthylation Fixation de MeCP2 dans des cellules non permissives

58 Restriction par méthylation du promoteur

59 Vecteurs non intégratifs:
Deux possibilités: Intégrase Les séquences att.

60 Sur CD34+

61 Analyse des jonctions de LTR: seuls les les wt/int+ sont classiques

62 BIO-SÉCURITÉ Lors de la production: Recombinaisons:
Entre les séquences recombinantes Avec des séquences endogènes Mobilisation de virus endogènes Chez le patient: +/- Idem Pathologie de l ’intégration Modes de contrôles: Lignées cellulaires Utiliser un bon modèle animal

63 Les RCLs Développement de tests sensibles de détection des RCLs
Le test doit considérer la structure des RCLs ????

64 Structures possibles des RCL
Tout RCL doit exprimer Gag-Pol Le Gag-Pol doit provenir du vecteur R-U5 U3-R Env(v) gag-pol(e) gag-pol(v) Env(e) Rechercher l’activité RT (Pol). Rechercher des virus réplicatifs

65 Tests de RCL F-PERT assay comme première ligne
Fluorescence-based Product Enhanced Reverse Transcriptase Assay PCR assay pour les résultats ambigus de PERT assay

66 Reverse transcription de MS2 RNA
F-PERT: Product Enhanced Reverse Transcriptase Assay (MLV, AMV, HIV-1/2, EIAV, …) NP-40 Reverse transcription de MS2 RNA MS2 phage RNA RT primer Pol VLP MS2 cDNA ABI Prism 7700 (TaqMan) pol (10-100/virion) Independent de la nature générant les RCLs Haute sensitbilité ( particles) Peu de faux positifs

67 Sensibilité du F-PERT Ct Activités RT MLV (Mn2+) et EIAV (Mg2+). 42 40
38 36 34 32 30 Ct 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 MLV neat MLV-1 MLV-2 MLV-3 MLV-4 MLV-5 EIAV neat EIAV-1 EIAV-2 EIAV-3 EIAV-4 EIAV-5 Media Media/DB water/DB water MS2cDNA MLV undisrupted EIAV undisrupted Activités RT MLV (Mn2+) et EIAV (Mg2+).

68 Réduire la genèse et l’impact de RCL
Utiliser virus non pathogénique Séparer les éléments en au moins trois plasmides Cellule productrice stable élimination des séquences non codantes et codantes en cis Réduire la recombinaison homologue Réduire l’empaquetage non spécifique Test sensible des RCLs

69 LentiVecteur et Vecteur Retroviral
Cross Transmission: LentiVecteur et Vecteur Retroviral 1.0E+02 1.0E+03 1.0E+04 1.0E+05 1.0E+06 1.0E+07 1.0E+08 génome EIAV génome HIV génome MLV Titre (TU per ml) Gag-Pol EIAV HIV MLV EIAV et HIV moins de 1/1000 EIAV and MLV peu mobilisés par HIV NB: MLV est déjà utilisé pour les patients HIV

70 Vecteurs Self Inactivating (SIN)
SIN LTR * CMVp LacZ Y mRNA Très faible expression de l’ARN génomique Les vecteurs SIN ne peuvent pas être introduits dans les lignées productrices par transduction.

71 EIAV LTR et SIN Vectors Y 8.1SIN 8.0 LTR 8Z20 CMV 5 8,742 11,133
Y copies par actine 5 8,742 11,133 35,116,825 SIN Control LTR CMV

72 Les « human SCID-X1 » Déficit:
Récepteur des interleukines ( ) Approche thérapeutique: Traitement ex vivo de la moelle osseuse Administration d ’un rétrovirus recombinant Réinjection

73 T Lymphocytes development after gene therapy of SCID-X1
9000 * P4 7000 > 3x106 CD34+ c +/kg 1x106 CD34+ c +/kg 5000 T Lymphocytes/µl * P10 P8 * P7 3000 P2 * P6. P5 1000 P9 P1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 months after gene therapy Patients living in a normal environment (4.4-8 years)

74 TRECs in SCID-X1 patients after gene therapy
TREC/1x105 PBMC Levels of TRECs in PBMC 10000 P8 P7 P2 1000 P1 P10 100 P6 10 P4 P5 1 0,1 20 40 60 80 100 months post- gene therapy

75 SCID-X1 gene therapy trial: 4 proliférations tumorales
Age (month) 1 3 8 11 Occurrence du SAE (month) 30 34 33 68 CD34+gc/kg 20 18 11.3 4.3 Clonal T cell proliferation  mature T  matureT Immature T Translocation 6:13 SIL-TAL,trisomy10 absent Sensitivity to treatment - + (+) Oncogène ciblé LMO2 BMI-1,LMO2,JUN-D CCND2

76 Sites d‘intégration P10 25.240 pb 49.499 pb 10.630 pb 9.319 pb
BMI1 1 2 3 4 MFG c 5 6 7 8 9 10 11 2 SPAG6, chr10p12.31 pb pb 2 MFG c 4 1 2 3 4 5 6 LMO2, chr11p13 pb Intergenic, chr19p13.11 JUND MFG c MFG c LSM4 9.319 pb

77 LMO-2 gene structure and integration of the provirus
1 2 3 4 5 6 MFG gc LMO-2 mRNA 2. 3 kb P5 P4 Enhancer activity P10 M. erythroleukemia LMO-2 RNA Transcript (Northern blot analysis) LMO-2 Protein expression (Western blot analysis) LMO-1 leukemia H. erythroleukemia P4 gd T CHO CHO/LMO-2 M-erythroleukemia LMO-2

78 Large-scale analysis of provirus integrations on SCID-X1 patients PBMCs
*572 IS mapped to the human genome *62% in genes (+/- 10 kb) *Significant peak of insertion frequency was related closely to the TSS (28% within 5 kb surrounding the TSS)

79 Insertions in gene regions Transcription Start Site
18 % 16 % 14 % 12 % 10 % 8 % 6 % 4 % 2 % 0 % 50% to 100% 80% to 90% 70% to 80% 60% to 70% 50% to 60% 40% to 50% 30% to 40% 20% to 30% 10% to 20% 0% to 10% 5 kb -5 kb Insertion G in % 7 % 6 % 5 % 4 % 3 % 2 % 1 % 0 % Distance from transcription start site (kb) -1 to 0 -2 to-1 -3 to-2 -4 to-3 -5 to-4 -6 to-5 -7 to-6 -8 to-7 -9 to-8 -10t o-9 9 to 10 8 to 9 7 to 8 6 to 7 5 to 6 4 to 5 3 to 4 2 to 3 1 to 2 0 to 1 Transcription Start Site

80 Molecular functions of targeted genes
Number Kinase activity 26 Membrane receptors-associated signaling proteins 11 Phosphotransferase activity DNA binding proteins 48 Transcription factors 22 Significantly different from integration by chance p < 0.016

81 Perspectives Intégration site spécifique Développement des formes non intégrées??? Labilité des particules Maîtrise de l’expression: promoteur, insulateurs. Administration in vivo: SNC: oui IV ???????