Métabolisme du glucose et lactose

Présentation au sujet: "Métabolisme du glucose et lactose"— Transcription de la présentation:

1 Métabolisme du glucose et lactose
Perméase au lactose perméase glucose Membrane bactérienne Glucose + Galactose Glucose Lactose β-galactosidase Glycolyse Energie + Carbone Croissance L’utilisation du lactose implique les mêmes enzymes que celles nécessaires pour le glucose mais aussi une perméase et la β-galactosidase

2 L’opéron lactose: un ensemble de gènes régulés par un opérateur
En absence de lactose : lac I P O+ lac Z lacY lacA Transcription Traduction P: promoteur, séq reconnu par s (ARN pol) O: opérateur, séq reconnue par I (répresseur) Répresseur I En présence de lactose : ARN pol σ lac I + P O+ lac Z lacY lacA Non actif en présence de lactose lactose

3 Un seul ARNm, 3 protéines : ARNm polycistronique
lac I P O+ lac Z lacY lacA σ RBSZ RBSY RBSA perméase β-galactosidase acétylase

4 Croissance dans un milieu contenant du glucose ET du lactose
Densité Optique temps Le glucose empêche l’utilisation des autres sucres (même phénomène avec le maltose) : répression catabolique. Le modèle proposé n’explique pas cela… Consommation du glucose Adaptation métabolique Consommation du lactose

5 Recherche de mutants qui « miment » l’effet du glucose
mutant cya1- : adénylate cyclase (production d’AMPc) : - en absence d’AMPc (cya1-), la cellule pense qu’il y a du glucose dans le milieu; pas de transcription de l’opéron lactose mutant cap1- ou crp1- : catabolic activator protein1 (ou cAMP Receptor Protein 1): - en absence de CRP1, la transcription de l’opéron lactose est abolie dans les conditions où normalement lacZ, lacY et lacA sont transcrits : la protéine CRP est un activateur de la transcription. La protéine CRP1 fixe l’AMPc; la fixation de l’AMPc lui permet de se fixer sur l’ADN à proximité du promoteur.

6 Les régions promoteur et opérateur de l’opéron lactose
GTGAGTTAGCTCACTCA TGTG-GAA-TTGTGAGCGGATAACAATTTCACA CACTCAATCGAGTGAGT ACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT

7 En présence de glucose et lactose Lactose Glucose
Perméase au lactose perméase glucose Membrane bactérienne cya Glucose + Galactose Glucose Lactose β-galactosidase Glycolyse σ CRP1 lac I + P O+ lac Z lacY lacA Transcription de l’opéron lactose très faible

8 En absence de glucose Lactose Membrane bactérienne cya Glucose +
Perméase au lactose perméase glucose Membrane bactérienne cya Glucose + Galactose Glucose Lactose β-galactosidase ATP AMPc + PP Glycolyse CRP1 CRP1 σ CRP1 lac I + P O+ lac Z lacY lacA opéron lactose actif

9 L’opéron lactose : bilan
Régulation négative par un répresseur : en absence de lactose, le répresseur est fixé sur l’opérateur et maintient la transcription dans un état réprimé. En présence de l’inducteur (lactose), le répresseur est inactivé et quitte l’opérateur: c’est l’induction Régulation positive par un activateur : En absence de glucose, [AMPc] est forte. La protéine CRP fixe l’AMPc et devient capable de reconnaître une région proche du promoteur. Elle interagit avec l’ARN pol et facilite son recrutement en -10 et -35 du promoteur. Le modèle opéron de Jacob et Monod : établi d’après l’opéron lactose Un opéron comprend un certain nombre de gènes régulés par un seul promoteur et éventuellement un opérateur. L’ARNm produit est polycistronique. L’expression des gènes contenus dans l’opéron nécessite l’interaction entre des séquences cis (promoteur et opérateur) et des séquences trans (facteurs de transcription).

10 Concentration en enzyme
L’opéron tryptophane Il contrôle l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse de tryptophane Pas de Trp Dans le milieu Trp disponible dans le milieu Concentration en enzyme du métabolisme du trp Enzyme Temps La cellule évite de synthétiser les enzymes responsables de la biosynthèse de tryptophane quand cet acide aminé est disponible dans le milieu

11 Pas de tryptophane dans le milieu
trpR O P aporépresseur trpE trpD trpC trpB trpA trpL Gènes de structure Biosynthèse du trp σ Beaucoup de tryptophane dans le milieu corépresseur (tryptophane) répresseur aporépresseur Gènes de structure trpR P O trpL trpE trpD trpC trpB trpA

12 Un peu de tryptophane dans la cellule
Mauvaise répression car peu de co-répresseur aporépresseur Gènes de structure trpR P O trpL trpE trpD trpC trpB trpA σ ARNm « atténué » Inhibition de l’élongation de la transcription : l’atténuation

13 Structure de l’ARNm atténué
Lorsque la boucle 1/2 se forme, la boucle 3/4 peut aussi se former. La boucle 3/4 a la structure d’un terminateur de transcription. 1 4 3 2 UUUUUUU Lorsque la boucle 2/3 se forme, ni la boucle 1/2, ni la boucle 3/4 ne peuvent se former. La boucle 2/3 est la moins stable des boucles UUUUUUU 1 4 3 2

14 Suffisamment de tryptophane disponible pour la traduction
L’atténuation Seul l’ARNm atténué est produit Suffisamment de tryptophane disponible pour la traduction L’opéron trp est transcrit Le tryptophane disponible pour la traduction est en quantité limitée C’est la vitesse de traduction du ribosome qui conditionne l’arrêt de la transcription

15 L’atténuation: couplage transcription/traduction

16 L’opéron tryptophane un double système de régulation
lors de l’initiation de la transcription : ce système détecte une concentration globale de trp dans la cellule et agit par un répresseur. lors de l’élongation de la transcription : ce système détecte la quantité de tryptophane disponible pour la traduction en mesurant la vitesse de passage des ribosomes au niveau des codons trp. Ce système fonctionne par un mécanisme d’atténuation qui implique un couplage transcription/traduction. L’atténuation est impossible chez les eucaryotes.

17 Régulation par inhibition de la traduction: ARN antisens
OmpF et OmpC sont des porines (protéines de la membrane externe d’E. coli) différentiellement exprimées en fonction de l’osmolarité du milieu La protéine régulatrice OmpR phosphorylée peut se fixer soit sur le promoteur du gène OmpF, soit sur celui d’OmpC. Quand l’osmolarité est faible, la quantité d’OmpR phosphorylée est faible et la protéine se fixe préférentiellement aux sites de haute affinité présents sur le promoteur OmpF. Quand l’osmolarité est élevée, la quantité d’OmpR-P augmente et peut alors se fixer sur les sites de faible affinité présents au niveau des promoteurs ompF et OmpC/micF. OmpC peut alors être produite, et l’ARN micF non codant se fixe par complémentarité de bases au niveau de la séquence RBS du transcrit d’OmpF, empêchant ainsi sa traduction ARN antisens).

18 Duplex formé par l’ARN micF et l’extrémité 5’ de l’ARNm d’OmpF (Yersinia pestis)

19 Différents niveaux de contrôle de l’expression des gènes (eucaryotes)

20 Régulation de l’initiation de la transcription chez les eucaryotes
La RNA polII est incapable de reconnaître les promoteurs; l’initiation de la transcription nécessite des facteurs généraux (TFII’s) présents dans tous les types cellulaires . TATA Région transcrite La régulation de la transcription est assurée par des séquences cis appelées enhancers (UAS : activation) ou silencers (URS : repression), sur lesquels se fixent des facteurs de transcription spécifiques. La position des enhancers et silencers est relativement indépendante de celle du site l’initiation de la transcription. Enhancer ou silencer Région transcrite

21 Mise en évidence des régions cis : méthode gène rapporteur
Activité Région transcrite 100% Gène rapporteur 100% Gène rapporteur 250% Gène rapporteur 10% Gène rapporteur silencer enhancer La méthode gène rapporteur permet de définir les zones cis et d’établir leur fonction (enhancer/silencer)

22 Les gènes rapporteurs outils en génétique du développement pour visualiser l’expression d’un gène
La séquence de régulation de la myogénine a été placée en amont du gène rapporteur lacZ de E.coli chez la souris. Des embryons agés de 11 jours ont été sacrifiés et incubés en présence de X-gal Toutes les cellules contiennent le gène rapporteur, mais seules un petit nombre l’expriment

23 Oligonucléotide radioactif
Méthode gel-retard + + + + Oligonucléotide marqué + + + Facteur de transcription + + Oligo froid compétiteur wt m Oligonucléotide radioactif + protéine Oligonucléotide radioactif Electrophorèse sur gel en condition NON dénaturantes : l’interaction protéine ADN n’est pas perturbée.

24 Les facteurs de transcription ont une structure modulaire

25 Les principaux domaines des facteurs de transcription
Motif Helix-Turn-Helix Motif Zinc finger Motif basique en général associé aux protéines à motif Leucine Zipper (b-Zip) ou Helix-Loop-Helix (b-HLH)

26 Domaine HTH et exemples de protéines à domaine HTH
FT procaryotes

27 Domaine « doigt de zinc »
Type C2-H2 ou C4 Ex : Récepteur d’hormones stéroïdes (type C4), facteur SP1 (3 répétitions C2-H2)

28 Domaine « doigt de zinc »
Les protéines à doigt de zinc en possèdent généralement plusieurs. Certaines peuvent former des dimères.

29 Le motif « Helix-Loop-Helix » (b-HLH)
Les hélices servent à la formation de dimères. Une région basique sert à la reconnaissance de l’ADN

30 AA hydrophobes (dont Leu)
Le motif « leucine zipper » (b-Zip) AA hydrophobes (dont Leu) Comme pour les domaines HLH, les hélices servent à la formation de dimères et une région basique interagit l’ADN

31 Le motif « leucine zipper »
Exemple d’hétérodimère formé par les protéines FOS et JUN (complexe AP1)

32 Intérêt des structures dimériques
Augmente la diversité permet la régulation

33 Modes d’actions des facteurs de transcription :
1- Interaction directe entre l’activateur et le complexe d’initiation de la transcription Système courant chez les procaryotes, rare chez les eucaryotes

34 Modes d’actions des facteurs de transcription :
2 - recruter le médiateur Structure modulaire composée d’au moins 20 sous unités dont aucune ne fixe l’ADN. L’interaction du mediateur avec l’activateur facilite l’entrée de la RNA polymérase II et active l’initiation de la transcription. L’efficacité de l’interaction entre médiateur et RNA polII dépend du nombre et de la nature des activateurs (dans ce schéma composite, il y en a 3, GCN4 (levure), VP16 (virus) et GAL4(levure)). Leur interaction avec des domaines différents du médiateur facilite le recrutement de celui-ci au niveau du promoteur : de cette manière, le médiateur intègre donc les signaux cellulaires en modulant l’activité de la RNA poIII.

35 Modes d’actions des facteurs de transcription :
3 – modifier la structure de la chromatine Complexe SWI/SNF

36 Différents niveaux de contrôle de l’expression des gènes (eucaryotes)

37 Les régulations post-transcriptionnelles
Epissage U1, U2, U4, U5 et U6 sont des snRNPs D’après Molecular Cell Biology, Lôdish et coll. Freeman Ed.

38 Les régulations post-transcriptionnelles
Epissage alternatif Pourrait concerner 40-75% des gènes humains Chaque exon peut constituer un module fonctionnel propre (ex. domaine de liaison à l’ADN, séquence d’adressage, site actif d’une enzyme…)  l’épissage alternatif peut générer des protéines avec des fonctions diverses à partir d’un seul gène.

39 alpha-Tropomyosin gene organization (rat) and seven alternative splicing pathways

40 L’épissage alternatif : un mode de régulation post-transcriptionnel
Exemple du déterminisme du sexe chez la drosophile

41 Les acteurs du déterminisme du sexe chez la drosophile
Doublesex (DSX) et fruitless P1 (FRU P1) sont des facteurs de transcription qui régulent l’expression des gènes qui détermineront un organisme mâle ou femelle. La protéine DSX existe sous deux formes distinctes, une produite chez la femelle, et une chez le mâle; FRU P1 n’est produite que chez le mâle. La production de ces protéines est sous la dépendance des protéines TRA et TRA-2. La production de TRA est elle-même contrôlée par la protéine Sex Lethal (SXL), laquelle n’est produite sous forme active que chez la femelle. Ces évènements en cascade sont contrôlés au niveau de l’épissage.

42 L’épissage alternatif : un mode de régulation post-transcriptionnel
Exemple du déterminisme du sexe chez la drosophile Déterminé indépendamment dans chaque cellule de l’organisme tôt au cours du développement. Les analyses génétiques montrent que ce déterminisme dépend de gènes autosomiques et hétérochrosomiques (le rapport X/A). Les gènes numérateurs, N, (chromosome X) codent des facteurs de transcription bHLH activant Sxl (Sex lethal); les gènes dénominateurs , D, (autosomiques), codent des protéines inhibant l’activité de ces facteurs. Selon le nombre de protéines actives, le sexe est mâle ou femelle

43 Le gène Sxl ne code une protéine fonctionnelle que dans les femelles
Régulation transcriptionnelle tôt dans le développement (2h après la fécondation) N D UGA N N E2 E3 E4 E5…E10 E1 PE E4 E5…E10 E1 SXLp PE (E: Early) n’est utilisé que chez la femelle transitoirement au cours du développement, sous l’influence d’activateurs de transcriptions produits pas les gènes numérateurs. La protéine SXLp n’est donc produite que chez la femelle

44 SXLp tronquée, inactive
Régulation post-transcriptionnelle plus tard (L: Late) : épissage alternatif Mâle UGA 1 E1 E3 E4 E5…E10 E2 PL PE UGA SXLp tronquée, inactive 1 E2 E3 E4 E5…E10 E2 Sxl masque la jonction I2/E3 Femelle UGA 1 E3 E4 E5…E10 E1 E2 Sxl PL PE SXLp’ 1 E4 E5…E10 E2 La protéine Sxl module l’épissage de son propre transcrit

45 tra (transformer) n’est produite que chez la femelle
Mâle Femelle Sxl masque la jonction I1/E2 UGA UGA Sxl tra 3 1 2 3 tra (transformer) n’est produite que chez la femelle Tra/tra2 facilite la reconnaissance de la jonction I3/E4 1 3 6 5 2 4 tra tra2 Dsx-F 1 3 4 6 5 2 Dsx-M AUG UGA Dsx (Double sex) Réprime la transcription de gènes « femelle-spécifiques » Réprime la transcription de gènes « mâle-spécifiques » Les protéines Dsx-M et Dsx-F ont des domaines de reconnaissance de l’ADN différents

46 Autres niveaux de régulation post-transcriptionnels :
Modulation de la durée de vie des ARNm m7G (A)n decapping deadenylation La stabilité des ARNm varie de quelques minutes à quelques heures. Les séquences riches en A et U de l’extrémité 3’ de l’ARNm le déstabilisent

47 Exemple de contrôle de la ½ vie d’un ARNm
Récepteur de la transferrine Récepteur de la transferrine Récepteur de la transferrine (captage du Fe circulant) et ferritine (stockage intracellulaire du Fe et élimination) ont des activités antagonistes vis-à-vis du Fe. Leur production est régulée différentiellement: en cas de carence, la production du récepteur de la transferrine est favorisée, celle de la ferritine au contraire est inhibée. Quand les besoins cellulaires en Fe sont satisfaits, la régulation inverse se produit.

48 Exemple de contrôle de la demie-vie d’un ARNm
Récepteur de la transferrine Pas de fer dans la cellule Assez de fer dans la cellule Boucle IRE IRP Fe IRP IRP ARNm récept. transferrine ARNm récept. transferrine IRP IRP IRP (A)n (A)n Traduction Production du récepteur de la transferrine Dégradation de l’ARNm Pas de production du récepteur de la transferrine Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 93, pp. 8175–8182, August 1996

49 (en affectant l’initiation de la traduction)
Exemple de contrôle de la traduction d’un ARNm Une protéine IRP contrôle également la traduction de l’ARN de la ferritine (en affectant l’initiation de la traduction)

50 Différents niveaux de contrôle de l’expression des gènes (eucaryotes)
½ life

51 Contrôles post-traductionnels : adressage différentiel, phosphorylations, dégradation
NF-kB et la réponse inflammatoire

52

53 Merci !

54

55

56 D’après Molecular Biology of the Cell ; Alberts et coll. 2002
Générer des messages complexes et stables dans le temps Le promoteur intègre les différents signaux de régulation D’après Molecular Biology of the Cell ; Alberts et coll. 2002 NON TRAITE EN 2010/2011

57 Rôle de Sxl chez la femelle
Lorsqu’un programme s’établit, il peut être nécessaire de le maintenir : boucles d’autorégulations positives Rôle de Sxl chez la femelle NON TRAITE EN 2010/2011

58 Lorsqu’un programme s’établit, il peut être nécessaire de le maintenir : boucles d’autorégulations positives D’après Molecular Biology of the Cell ; Alberts et coll. 2002 NON TRAITE EN 2010/2011

59 Boucles d’autorégulations positives
Ex. : déterminisme de l’œil chez la drosophile NON TRAITE EN 2010/2011

60 L’expression ectopique de ey détermine la formation de l’œil en absence de signal
NON TRAITE EN 2010/2011

61 Les modifications de la structure de la chromatine permettent de stabiliser un état physiologique dans le temps : modifications épigénétiques NON TRAITE EN 2010/2011

62  insulators  Localisation de la protéine BEAF32 sur les chromosomes polytènes Fonctionnement des insulateurs NON TRAITE EN 2010/2011

63 Conséquence de l’effet combinatoire
NON TRAITE EN 2010/2011

64 Formation des cellules du muscle strié squelettique
NON TRAITE EN 2010/2011

65 Formation des cellules du muscle strié squelettique
NON TRAITE EN 2010/2011

66 « CLONAGE » Noyau d’une cellule différenciée inséré dans un ovule énuclée - déprogrammation du noyau de la cellule différenciée….(facteurs cytoplasmiques de l’ovule?) - programmation du noyau comme celle des cellules embryonnaires… - marche peu 1-5% Réimplantation Différenciation in vitro… NON TRAITE EN 2010/2011

67 Cellules souches et différenciation in vitro
NON TRAITE EN 2010/2011

68 Cellules souches embryonnaires injectées à une souris
Tératomes (masse de cellules contenant endoderme, mésoderme, ectoderme Plus ou moins différenciés) NON TRAITE EN 2010/2011