JOURNEES DES AVRIL 2014 ROUEN.

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1 JOURNEES DES AVRIL 2014 ROUEN

2 PLAN - Introduction - Tube digestif
- Définition du Microbiote intestinal - Méthodes de caractérisation - Composition - Établissement, stabilité, Adaptabilité - Fonctions - Dysbiose - Applications thérapeutiques - Conclusion - Bibliographie

3 TUBE DIGESTIF

4 10x plus de bactéries dans l'intestin que de cellules dans le corps humain !!!!!!!
Grande Surface 400m2 !!! X2

5 DEFINITION MICROBIOTE INTESTINAL

6 MICROBIOTE = -10 bactéries : 10 fois le nb de cellule de l’organisme
communautés de micro-organismes qui résident ou transitent dans le tube digestif. - Microbiote = organe composé principalement de cellules procaryotes Écosystème complexe de > micro organismes principalement des bactéries présent dans notre tube digestif bactéries 10x le nombre de cellules de l'organisme ! 100 X plus de gènes que dans le génome humain 14 -10 bactéries : 10 fois le nb de cellule de l’organisme environ 100 fois plus de gènes que le génome humain - >500 espèces différentes réparties le long du tube digestif

7 METHODES DE CARACTERISATIONS

8 Seulement 20-30% des bactéries du tractus digestif sont cultivables par les méthodes classiques de culture A-

9 - méthodes de séquençage - empreintes - PCR quantitative
> Utilisation ARN ribosomal 16S en tant que marqueur de la diversité génétique > Gène codant l’ARN 16S (ADNr 16S) présent chez toutes les bactéries - méthodes de séquençage - empreintes - PCR quantitative - Hybridation in situ - METAGENOMIQUE = étude des génomes de l’ensemble des organismes présents dans un échantillon ( MICROBIOME <-> Génome associé au Microbiote) - Caractérisation du microbiote en utilisant l' ARN Ribosomal 16S en tant que marqueur de la diversité génétique. Le gène qui code l'ARN 16S est présent chez toutes les bactéries permettant ainsi l’étude qualitative et/ou quantitative de la diversité bactérienne. - parmi ces techniques Moléculaires nous pouvons citer : les méthodes de séquençage, l'hybridation in situ.. → ces techniques permettent d’évaluer la composition mais ne donnent pas d'informations sur les fonctions de ce microbiote => nouvelles approches basées sur la METAGENOMIQUE

10 COMPOSITION

11 COMPOSITION ET FACTEURS DE VARIATIONS
- La composition du Microbiote évolue tout au long du tractus digestif, avec une densité bactérienne suivant un gradient oro-anal. - Citez rapidement les différentes Bactéries constituant chacune des parties avec la densité bactérienne associée Les conditions écologiques diffèrent considérablement le long du tractus dig - ph ( augmente au fur et à mesure) - potentiel d’oxydoréduction - anaérobiose : taux d'O2 diminue au fur et à mesure - vitesse du transit qui diminue au fur et à mesure => ce qui explique les variation du microbiote le long du tube dig .

12 FLORE COLIQUE Flore colique composé de 3 phylas ( = espèces) majeures)
1 Firmictus 60-75% 2 Bacteroides % 3 Actinobacterium 1-5% Le phylum proteobacterium <1% L'ensemble de ces 3 phylas majeurs + 6 genres bactériens constituent à eux seuls 90% des espèces bactériennes chez tous les individus . Les genres bactériens appartiennent aux différents phylas ( cf l'arbre phylogénique sur l'ancienne version) - bacteroides → phyla Bacteroidetes - eubacterium + clostridium + lactobacilus → phyla firmictus - enterococcus + bifidobacterium → phyla actinobacteria

13 FLORE DOMINANTE – SOUS DOMINANTE
10-20 espèces avec Niveau de population élevé Flore SOUS-DOMINANTE Flore de passage Bactéries Anaérobies Surtout BGN non sporulés Bacteroides +++ BG+ = eubacteria, clostridia Bifidobacterium Catenabacterium Cocci GP - Flore dominante : +++ dans le colon principalement, composé par des bactéries anaérobies strictes dont les taux sont les plus importants > 10 8 germes/g . ACTIVE et PROTECTRICE. - Flore sous dominante : localisé dans le colon, à des taux inférieurs à ceux des germes de la flore dominante soit < 10 8 germes/g. Composée de germes anaérobies facultatifs (enterobacteries, streptocoques) INACTIVE → Intérêt : en dessous du seuil de 10 8 les bactéries appartiennent à la flore sous dominante et n'exercent aucun effet car leur nombre est trop faible. On peut être porteur sain de bactéries dangereuses tant qu'elles restent en sous-dominance puisqu'elles sont alors inactives. On voit ainsi l’intérêt de maintenir une flore active et protectrice. - Flore de passage variable, transitoire,, faible concentration taux <10 6 germes/g. Polymorphe, composée de bactéries en transit, levure. Sauf circonstances pathologiques elle est incapable de s'implanter dans le tube digestif et d'exprimer son potentiel pathogène. Bactéries aero/anaérobies facultatives Enterobacteries, strepto, Entérobacteries Citrobacter, klebsiella, proteus Levures Candia albicans présent dans 50-60% cultures.

14 ETABLISSEMENT, STABILITE, ADAPTABILITE DU MICROBIOTE

15 - In utero tube dig stérile
- à l'accouchement dés rupture des membranes colonisation par 1éres espèces aero-tolérantes car l'intestin du NN est pourvu d'O2 - puis après quelques jours milieu se réduit en O2 et implantation des anaérobies strictes - avec la diversification ( notamment passage à une alim solide) : Dvpt des enterobacteries Diminution des bifidobacteries Acquisition d 'espèces spécifiques du colon - Vers 2 ans l’équilibre population bactérienne intestinale est atteint : diversité caractérisée par forte proportion d’anaérobies strictes et - forte proportion d’anaérobies facultatives. => Microbiote se stabilise au fur et à mesure qu'il se diversifie

16 Les facteurs influençant l’établissement et la stabilité du microbiote au cours de la vie 
1. Génétique de l'hote durant toute la vie 2. Facteurs environnementaux : > Mode d'accouchement : Césarienne : bacteries peau maternel ++ Voie basse : on retrouve des germes des voies génitales > Traitement ATB : entraînent des altérations quant et qualit durant toute la vie > Alimentation : Enfance genre dominant → NN au sein : bifidobacteries ++ → NN allaité artificiellement : bacteroides + lactobacillus ++ → diversification solide 6 mois : augmentation firmictus ++ augmentation diversité des espèces Adulte → genre bactérien dominant associé au régime suivi à long terme > Hygiène => application direct de ces influences : on peut donc agir sur la compo du microbite. CONDITIONS D' HYGIENE

17 3. SPECIFICITE. Chaque individu : Héberge environ 200 espèces
A un Microbiote qui lui est propre On peut classer les individus selon leur Entérotype. On peut classer les individus selon leur enterotype, statistiquement certains micro-organismes s’associent entre eux. Par ex l’entérotype 2 est caractérisé par peu de bacteroidetes, beaucoup de provetella et des taux intermédiaires de ruminococcus.

18 FONCTIONS

19 Synthèse Absorption Épithélium Intestinal
Fonction métabolique essentielle : - synthèse : Vitamines du groupe B (B1, B2, B3, B6, B12) Vitamine K Folate - production d'acides aminés - absorption d'ions Mg, Ca, fer - transformation des acides biliaires + divers xénobiotiques (substances médicamenteuses) → deconjugaison des acides bilaires ( ou d'autres substances) par des bactéries du microbiote augmente leur liposolubilité donc les rends plus absorbables par la muqueuse colique et permet leur circulation entero-hépatique. → bactéries participent à 'activation de certaines substances médicamenteuses comme les composés imidazolés, peuvent transformer la digoxine en produit inactif Absorption

20 Fermentation des glucides ++++++
AGCC GAZ La fermentation microbienne a lieu physiologiquement dans le colon - les fibres et substrats glucidiques complexes sont transformés en fragments oses simples par les bactéries fibrinolytiques. - puis ces fragments empruntent différentes voies pour être convertis en produits de fermentations : AGCC et GAZ et à moindre importance en produits intermédiaires de fermentation. AGCC ( acides gras à courtes chaînes) et GAZ : → transformés AGCC 3 métabolites terminaux essentiels ++ acétate propionate butyrate nutriments pour les cellules intestinales ++ (donner leurs fonctions) Gaz : hydrogène, gaz carbonique. L'hydrogène peut être sécrété tel quel ou transformé en méthane CH4 (par methanobrevibacter) ou en SH2 ou en acétate. Les gaz produits sont éliminés sous forme de flatulence et par voie pulmonaire. → absorbés par la lumière colique. (Produits intermédiaires ne s'accumulent pas dans l’écosystème mais vont à leur tour être métabolisés par d'autres espèces en produits finaux ) - - BUTYRATE : directement utilisé par l’épithélium colique tirant 60-70% de son énergie des produits de fermentation bactérienne. - ACETATE : fournit énergie au tissu musculaire + substrat à la synthèse de cholestérol. - PROPIONATE : utilisé par le foie pour la néoglucogénèse

21 Métabolisme des protéines
Par Protéases désamination - La dégradation des protéines dans le colon génère de nombreux métabolites potentiellement toxiques pour l'hôte : phénols, indole, amoniac … - Hydrolyse des protéines par enzymes protéolytiques ( protéases) aboutit à la libération de peptides. Peptides → assimilés par différentes espèces bactériennes → hydrolysés en AA pour les bactéries incapables d’ingérer les peptides Désamination des acides aminés conduit → formation AGCC ++ acétate butyrate propionate ++++ → formation d'amoniac : * principale source d'azote pour un très grand nombre d’espèces bactériennes dans le colon. Source d’énergie pour la synthèse protéique des bactéries et leur croissance. * absorbé par la muqueuse colique et transporté par la Veine porte jusqu'au foie ou il est converti en urée qui est excrétée dans l'urine. + → formation de phénols indole absorbés+ détoxifiés par la mqse colique et excrétés ds les urines d'acides dicarboxyliques et acides gras ramifiés ( toutes ces actions sont réalisées par différentes espèces bactériennes ayants des activités complémentaire → protéases, désaminases, décarboxylases qui interagissent pour assurer la dégradation et le métabolisme des protéines....) désamination

22 - bactéries commensales jouent un rôle de barrière contre les pathogènes ingérés :
Microbiote : → production de peptides anti-microbiens (bacteriocines) → redoutable compétiteur en terme d'occupation de niche bloquant alors l’accès des pathogènes aux sites d'ancrages et aux nutriments. → neutralisation des toxines produites par les germes pathogènes → module la teneur en mucines du mucus par stimulation de la différenciation des cellules calciformes. ( mucines qui servent de barrière entre l’épithélium intestinal et les bactéries)

23 - stimulation du développement et de la maturation de système immunitaire
- activation des cellules présentatrices d'Ag CPA - après activation par CPA les LT naif se différencient et s'activent en LT th1 LT th 2 → Th1 responsable réponse immunitaire cellulaire LT intra épithéliaux assurent le maintien de l’intégrité paroi intestinal → Th2 réponse Humorale avec synthèse IgA sécrétoire, à moindre importance synthés d'IgE - Régulation de la balance th1/th2 par le Microbiote

24 - La relation symbiotique unique entre les bactéries du microbiote et l'hôte passe egalement par l’interaction entre les motifs microbiens MAMPS et des récepteurs spécifiques PRR. - 2 types de PRR : Nod et TLR - 2 types de TLR : Transmembranaire ou intracellulaires à la surface de l'endosome - l'activation des TLR par les bactéries commensales déclenche : → la transcription de gène de cytokines via activation du facteur de transcription NfkB = production de cytokines pro inf TNF alpha , IL6, IL 12 → l'activation de facteur de transcription de la famille des IRF (interferon regulatory factor) à l'origine de la production IFN type 1. => en gros l'activation des TLR par les bactéries déclenche la transcription de gène de cytokines via le facteur de transcription NfkB en collaboration av facteur de transcription IRF grâce au recrutement de l'adaptateur moléculaire MyD88 ou d'autres adaptateurs contenant domaine TIR. -Famille NLR : 2 types de R présents dans le cytoplasme Nod 1 et nod 2 - Récepteurs peuvent reconnaître des composants du peptidoglycane (éléments de la paroi bactérienne) - puis laison de leur ligands - qui entraine une transduction du signal avec activation d'un facteur de transcription de la réponse inflammatoire (NF-kB) - ce qui aboutit à la transcription des gènes de cytokines pro-infammatoire => l'activation des récepteurs par les bactéries induit des facteurs de croissance et des cytokines exerçant un effet cytoprotecteur et réparateurs sur les cellules épithéliales

25 - Maturation épithélium intestinal - Vascularisation des villosités
- Renforcement des jonctions cellulaires - Augmentation de la cellularité du chorion - Augmentation des cryptes Cellule souche - Rôle dans le Microbiote dans la structure et la trophicité de l’épithélium : → maturation de l’épithélium intestinal → vascularisation des villosités → renforcement des jonctions cellulaires → augmentation de la cellularité du chorion → augmentation des cryptes → différenciation + prolifération des cellules épithéliales intestinales Le soucis c'est que les mécanismes physio pour ces rôles ne sont pas decrits, ils ont juste été mis en évidence via des expériences en comparant des souris axénique ( sans microbiote ) et des souris av microbiote)..... Cellule de paneth Différenciation + Prolifération des cellules épithéliales intestinales Développement de l’angiogenèse Jonctions renforcées

26 5. FONCTIONS EMERGENTES - Neuromodulation Relation Microbiote -Intestin- Cerveau - Rôle dans la régulation du stockage des graisses Lire la diapo Stockage des graisses interviendrait dans la physiopath de l’obesité

27 DYSBIOSE ET PATHOLOGIES

28 DYSBIOSE = état de déséquilibre
Ingestions de micro-organismes Prise IPP L' hôte et son Microbiote sont en interrelations SYMBIOTIQUES → des perturbations de l'un des deux peuvent retentir sur l'autre et déséquilibrer l'ensemble → différents facteurs perturbant l'equilibre : IPP, ATB, Voyages etc... on définit alors le terme de DYSBIOSE comme un état de déséquilibre qualitatif ou quantitatif du Microbiote Prise ATB Voyages, changements d'environnements DYSBIOSE = état de déséquilibre

29 Implications de la Dysbiose dans : - Infections intestinales
- Diarrhées aux ATB - Pullulation du grêle - Colites de diversion - MICI - SII - Cancérogènése dans le tractus digestif - Maladies extra-digestives : Syndrome Métabolique, Obésité Allergies

30

31 - dans les MICI : augmentation des bacteroidetes et baisse des Firmictus comparés aux sujets sains.
- augmentation des bacteroidetes et baisse des firmictus encore plus importante lors des MICI en poussée. Sokol et al. IBD 2009

32 =>=> Rôle anti-inflammatoire de F. prausnitzii
F. Prausnitzii est un Firmictus ++ =>=> Rôle anti-inflammatoire de F. prausnitzii

33 Ex : Diarrhées à Clostrium Difficile
Exposition à un ATB Dysbiose Transitoire homéostasie Exposition à C.D Dysbiose Persistante INFECTION à CD

34 MODULATIONS THERAPEUTIQUES

35 c v=> OBJECTIF = EUBIOSE
=> MOYENS : Approche Nutritionnelle modification des apports en fibres fermentescibles Approche Microbiologique Probiotique Prébiotique Symbiotiques ATB Transplantation Fécale - l'objectif est de remettre un état d’équilibre = EUBIOSE - différentes approches → nutritionnelle → microbiologique Probiotiques : micro-organismes vivants, ajoutés comme compléments à certains produits alimentaires ayant un effet bénéfique sur l'hôte. Prébiotiques  :composé alimentaire non digestible qui affecte l’hôte de façon bénéfique en stimulant de façon sélective la croissance et/ou l’activité d’une ou plusieurs espèces bactériennes dans le côlon → transplantation fécale

36 CONCLUSION - Microbiote intestinal = véritable organe complexe et riche - Unique = carte d’identité d’un individu - Interactions majeures avec l’hôte - Rôles : barrière + métabolique + immunologique - Implication dans de nombreuse pathologies en cas de déséquilibre - De nombreuses implications restent à explorer… Gigantesque et passionnant défi à relever !