Timothy S Fisher1,2, Pheroze Joshi1 and Vinayaka R Prasad*1.

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1 Timothy S Fisher1,2, Pheroze Joshi1 and Vinayaka R Prasad*1

2 Famille des retroviridae genre lentivirus 2 types de virus de L’immunodéficience humaine: VIH-1 et VIH-2 Génome constitué d’un ARN simple brin en double exemplaire 90-120 nm

3 Transcription de l'ARN virale en ADN viral par la transcriptase inversetranscriptase inverse Intègration de l’ADN viral à l'ADN cellulaire par l'intégraseintégrase Assemblage du virus par la protéaseprotéase

4 RT du VIH-1 multifonctionnelle : DDDP/RDDP, Rnase H, Transfer et déplacement de brin Cible majeure des thérapies antirétrovirales Mais : erreurs faites par la RT + fort taux de réplication contribue à l’émergence de variants résistants Primer template 3 approches efficaces basées sur a.nucléiques: Long ARN env antisens + vecteur antiviral RNAi DNA/RNA aptamers : très spécifiques et liaison forte à la RT (inhibition compétitive du template primer)

5 Expression d’aptamers ARN spé de la RT du HIV-1 : blocage de l’infection et de la diffusion HIV-1 dans culture cellulaire, chez 5 clades du HIV-1 et tous les isolats RTI et PI- resistants. Resistance aux aptamers difficile car interaction grand et forte avec la RT → 2 mutants isolés N255D N265D resistants à l’aptamer RT1T49

6 Polymérisation assays (radiomarquage) Chaque mutation confère une résistance, la double résistance augmente ce degré (IC 50 de 6 à 27 fois plus) N255D et DBL rendent la RT hypersensible à RT8 RT10 et Rknot semblables au sauvage pour N255D mais résistants pour N265D et Dbl N255 ET N265 sont donc d’importants contact pour ces aptamers

7 NRTiNNRTi Les mutations n’entrainent pas de modification sur la résistance des RT aux inhibiteurs : pas le même mode d’action que les aptamers

8 AZT ddl/ddC L74V et T215Y sensibles E89G, K65R et M184V résistantes à de multiples NRTis sont aussi résistants à RT1T49 E89 et K65 situés dans différentes régions de fixation du template : → l’aptamer RT1T49 doit être en contact avec plusieurs régions clés de la RT impliquées dans le contact avec le primer template

9 Challenge, polymerase-dependant and RNA 5’-end-directed cleavages : +héparine RTs résistantes à l’aptamers n’ont pas d’activité Rnase H pol-dépendante ni dirigée sur l’ext ARN5’ Activité résiduelle observée sans spécificité → les mutations N255 et N265 induisent une forte altération de l’activité Rnase-H

10 Unchallenge, polymerase-dependant cleavages: - héparine L’affinité de la RT pour le complexe ADN/ARN est diminuée par les mutations L’enzyme est toujours fonctionnelle → les mutations de résistance à l’aptamer affecte l’activité Rnase-H seulement par l’affinité au substrat

11 RT mutées résistantes à 3 aptamers avec niveaux équivalents à RT1T49 Résistance corrélée avec le K d N255 et N265 points de contact avec structures tertiaires des aptamers RT8 seul aptamer a améliorer l’interaction : hypersensibilité observée Les RTs résistantes aux aptamers restent sensibles aux NRTis et NNRTis Les mutations entrainent une altération de l’interaction entre la RT et le template primer et cela induit une suppression de la réplication De même l’activité Rnase H est affectée par la baisse d’affinité.

12 Le développement d’aptamers anti-RT permettrait d’en faire des agents anti-VIH Cela permettrait de répondre à l’échec des traitement chroniques antiviraux