Optimisation des conditions d’actions de la protéinase K au cours d’une hybridation in situ sur embryon de lamproie.

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1 Optimisation des conditions d’actions de la protéinase K au cours d’une hybridation in situ sur embryon de lamproie

2 Plan général

3 PARTIE ECONOMIQUE Le CNRS : son histoire, sa hiérarchisation, ses ressources, ses dépenses L’IEM : ses structures, ses projets L’équipe « développement et évolution des vertébrés » : ses projets

4 PARTIE SCIENTIFIQUE Introduction
L’hybridation in situ : une étape décisive Mise au point des conditions d’utilisation de la protéinase K Application du nouveau protocole

5 DISCUSSION Utilité de la mise au point Application à grande échelle
Aide précieuse pour la continuité de la recherche sur les vertébrés

6 PARTIE ECONOMIQUE

7 Le Centre National de Recherche Scientifique
19 octobre 1939 : création 1945 : recherche fondamentale Années 80 : unités mixtes de recherche Large spectre de connaissance, implantation partout dans l’hexagone

8 Le CNRS en chiffre 18 délégations 1256 unités de recherche
Plus de 4000 brevets déposés Création de plus de 100 entreprises depuis 1999 81 accords avec 50 pays

9 Les ressources du CNRS Subventions de l’Etat : 72%
Ressources propres : 15% Amortissements : 9%

10 Les dépenses du CNRS Masse salariale : 48% Fonctionnement : 23%
Amortissements : 9%

11 L’unité immunologie et embryologie moléculaire
Reconnaissance moléculaire et immunité innée Immunité acquise et allergie Morphogenèse et embryologie moléculaire Développement et évolution des vertébrés

12 L’équipe « développement et évolution des vertébrés »
Embryologie et histologie Génétique du développement : souris, lamproie Comparaison chez les autres vertébrés

13 PARTIE SCIENTIFIQUE

14 Introduction Lamproie : cyclostomes
À la base de l’évolution des vertébrés

15 Pourquoi la lamproie ? Étudier la génétique du développement
Définir les mécanismes moléculaires qui fondent ce groupe : les vertébrés Corrélations avec les autres vertébrés

16 L’hybridation in situ Peu connue chez la lamproie
Nécessite une mise au point Utilisation à grande échelle

17 Matériel et méthode

18 Technique d’hybridation
Synthèse de sondes ARN anti-sens Détection d’un brin d’ADNm sur l’embryon

19 Duplication de l’ADNc Intégration d’un ADNc dans le plasmide
Amplifié par réaction de polymérisation en chaîne

20 Synthèse de matrice PCR
Nécessaire en grande quantité pour la synthèse des sondes ARN Enzyme utilisée : Taq polymérase (72°C)

21 Principe de la PCR

22 Synthèse des sondes ARN
Transcription in vitro de l’ADN en ARN Incorporation d’un nucléotide marqué à la digoxigénine

23 Hybridation sur embryons in toto
Fixation des sondes ARN anti-sens synthétisées sur les ARNm cibles Fixation des anticorps anti-digoxigénine sur les sondes ARN Révélation chromogénique Visualisation des territoires d’expressions des sondes ARN

24 RESULTATS

25 Mise au point des conditions d’hybridation sur embryon de lamproie
Test des conditions type « roussette » Mise au point des conditions d’action de la protéinase K Tests des conditions sur deux nouveaux gènes : Pitxa1, NeuroD

26 Tests des conditions « roussette »
Photographie Résultats Conclusions Taches violettes Cassure sur la partie postérieure Débris de chorion Bruit de fond Cassure sur la partie antéro-dorsale

27 Conclusion du test Présence de bruit de fond : signaux spécifiques masqués Résultat insatisfaisant  Mise au point

28 Optimisation des conditions d’action de la protéinase K
Problème de bruit de fond : réglé Incubation à différents temps Détermination du temps d’action optimal

29 7.5min à 37°C 15min à 37°C 22.5min à 37°C 30min à 37°C 45min à 37°C
45min à température ambiante

30 Conclusion de l’optimisation
Apparition des signaux de manière progressive Bruit de fond éliminé Temps d’action optimal : 45min à 37°C

31 Test sur NeuroD Photographies Résultats - Observations
Signal spécifique dans tout le système nerveux de l’embryon

32 Discussions Conditions d’hybridations sur l’embryon de lamproie
Optimisation à petite échelle Application à grande échelle Mécanismes de la génétique du développement des vertébrés