Cinétique enzymatique -modèle de base de la cinétique enzymatique Michaelis –Menten -détermination des constantes cinétiques -Représentation hyperbolique.

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1 cinétique enzymatique -modèle de base de la cinétique enzymatique Michaelis –Menten -détermination des constantes cinétiques -Représentation hyperbolique (Michaelis-Menten ) -Représentation de Lineweaver-Burk -Inhibitions des réactions enzymatiques Inhibition compétitive IC50 pour inhibition compétitive inhibition non compétitive IC50 pour inhibition non compétitive inhibition in compétitive IC50 pour inhibition in compétitive Graphiques de Dixon Pr Miloud SLIMANI Département de Biologie Université de Saida (Algérie)

2 E + S E + P ES Complexe enzyme-substrat K1 K2 K-1
à t=0, la concentration du complexe enzyme-substrat, [ES], est égale à 0 à t=0, la concentration en produit est égale à 0 E = Enzyme S = Substrat P = Produit ES = Complexe Enzyme-Substrat k1 = constante de vitesse pour la formation d'ES :constante d’association E-S k-1 = constante de vitesse pour la décomposition d'ES en E + S : constante de dissociation E-S k2 = constante de vitesse pour la décomposition d'ES vers la formation des produits:constante catalytique (constante de vitesse de la réaction enzymatique)

3 Le modèle Michaelis et Menden

4 Influence de la concentration en enzyme
Influence de la concentration en substrat augmentation de ( E) augmentation de la Vi Augmentation de (S) augmentation de la Vi

5 k1 k2 k-1 E + S ES E + P Équation de Michaelis-Menten vi = k2 [ES]
La vitesse d’apparition du produit P (vitesse de la réaction catalysée par l’enzyme) dépend de k2 et de la concentration en ES. vi = k2 [ES] La [ES] dépend de sa vitesse de formation et de sa vitesse de disparition. vformation ES = k1 [E] [S] vdisparition ES = k-1 [ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]

6 où [ E ]T est la concentration totale d'enzyme
ES se forme à partir de E + S et se décompose soit en E + S , soit en E + P Vitesse de formation de ES: vf = k1·[ E ]·[ S ] Vitesse de dégradation de ES: vd = (k-1+ k2)·[ ES ] à l’état stationnaire de ES = constante [ ES ] atteint rapidement une valeur constante (condition dite de "steady state"), donc vd = vf (k-1+ k2)·[ ES ] = k1·[ E ]·[ S ] [ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] /Km KM = (k-1+ k2) /k1 = constante de Michaelis (-Menten) 1/Km [ E ] = [ E ]T - [ ES ] où [ E ]T est la concentration totale d'enzyme

7 [ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM
[ ES ] = [ E ]·[ S ] / KM [ E ] = [ E ]T - [ ES ] [ ES ] = ([ E ]T - [ ES ])·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM - [ ES ]·[ S ] / KM [ ES ] + [ ES ]·[ S ] / KM = [ E ]T·[ S ] / KM [ ES ]·( 1 + [ S ] / KM ) = [ E ]T·[ S ] / KM [ ES ]·(KM + [ S ]) / KM = [ E ]T·[ S ] / KM [ ES ]·(KM + [ S ]) = [ E ]T·[ S ] [ ES ] = [ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) l'équation pour la vitesse initiale: [ ES ] = [ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax·[ S ] / (KM+ [ S ])

8 vo = k2·[ ES ] = k2·[ E ]T·[ S ] / (KM + [ S ]) = vmax [ S ] / (KM+ [ S ])
L’équation de Michaelis-Menten vi = Vmax [S] KM + Vitesse initiale Vi

9 la réaction enzymatique suit une hyperbole => la réaction enzymatique est saturable
KM : index de l’affinité de l’enzyme pour le substrat - plus KM est petit plus l’affinité est grande - plus KM est grand plus l’affinité est faible -l’affinité est inversement proportionnelle à la valeur de KM

10 KM = [S] Constante de Michaelis-Menten KM KM [S] vi = Vmax + [S]
½ Vmax = Vmax [S] KM + Si vi = ½ Vmax ½ (KM + [S]) = [S] KM = [S] ½ KM = [S] - ½ [S] ½ KM = ½ [S] KM est la concentration en substrat pour laquelle l’enzyme fonctionne à la moitié de sa vitesse maximale KM est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme.

11 KM KM Représentations linéaires KM Lineweaver - Burk vi = Vmax [S] + 1
Si on écrit l’équation en double inverse : 1 Vmax [S] KM + vi = Vmax [S] KM + 1 vi = ou 1 Vmax [S] KM x vi = + Vmax = k2 [E]T = kcat [E]T

12 Représentation Lineweaver - Burk
1 Vmax [S] KM x vi = +

13 k2 est appelée constante catalytique ou kcat
k2 est appelée constante catalytique ou kcat . Elle est proportionnelle au nombre de réactions que peut effectuer une molécule d’enzyme par unité de temps ( le «turn-over number»). Vmax = kcat [E]T µmole de P. mL-1.sec-1 sec-1 µmole de E . mL-1 Kcat = nombre de moles de P formées par seconde et par mole d’enzyme. Si l’enzyme possède plusieurs sites catalytiques, l’unité change et s’exprime par mole de sites kcat/KM est l’efficacité catalytique de l’enzyme. 1/Kcat : est la durée , en s de l’acte catalytique Kcat : donne la mesure de l’efficacité de l’acte catalytique Lorsqu’un enzyme peut utiliser plusieurs substrats, kcat/KM permet d’estimer quel sera le substrat le plus utilisé par la protéine.

14 Unités d'activité enzymatique
L’unité international d’activité (U.I) : une unité est la quantité d’enzyme transformant 1µmol de substrat en produit par minute Katal : quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde L’unité usuelle est le nanokatal ( une nanomole de substrat transformé par seconde ) 1 U.I = 1 U.E. = 0,0166 μkat = 16,6 nkat 1 U.I = 1 µmol.min-1 ( signifie à ) nmol.s-1 =16.67 nkat Le nombre de rotations (Kcat) est le nombre de molécules de substrat transformées par molécule d'enzyme par seconde (ou le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme. l‘activité molaire, le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme par minute ( Kcat x 60). L’activité spécifique d’une enzyme (AS) : nombre d’unités d’activité par unité de masse (UI/mg de protéine ou µkat/mg) : activité totale / quantité totale de protéine, IU/mg. le rendement :(activité totale / activité totale avant la première étape de purification) le taux de purification :(activité spécifique / activité spécifique avant la première étape de purification). L'activité spécifique et le taux de purification atteigne une valeur maximale lorsque l'enzyme est pure

15 - Inhibiteur compétitif
Mode d’action des inhibiteurs Certains inhibiteurs s'associent de manière réversible à l'enzyme en interagissant de manière non covalente. D'autres se fixent de manière Irréversible et sont souvent utilisés pour déterminer les groupes actifs du site catalytique. Les inhibiteurs réversibles sont de trois types possibles qui se distinguent par leur mécanisme d’action : - Inhibiteur compétitif L’inhibiteur est un analogue de structure du substrat :c'est la fixation exclusive avec formation de complexes binaires ES ou EI . - la fixation non-exclusive avec formation de complexes ternaires (ESI). Si ce complexe ternaire reste encore actif (moins que le complexe ES), l'inhibition est dite partielle et s'il est totalement inactif, l'inhibition est dite totale. -Inhibiteurs non-compétitifs: fixation ailleurs qu’au site substrat empêchant la catalyse d’avoir lieu -Inhibiteurs incompétitifs: fixation à la place de l’autre substrat (dans une réaction avec deux substrats)

16 Inhibiteur compétitif : (fixation exclusive)
C'est un mécanisme où la fixation de l'inhibiteur empêche celle du substrat (et réciproquement) : la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont donc mutuellement exclusives. Un inhibiteur compétitif ne peut se fixer que sur l'enzyme libre sa fixation et celle du substrat étant exclusives l'une de l'autre. On peut lever l’inhibition par un excès de substrat car S et I ont des structures analogues. Schéma de type Michaelis Menten de l’inhibition compétitive

17 k1 k2 k-1 1/KM ki Ki [E]T = [E] + [ EI ] + [ ES ] E + S ES E + P EI E
Vitesse de formation de ES: vf = k1·[ E ]·[ S ] Vitesse de dégradation de ES: vd = (k-1+ k2)·[ ES ] k1 [E] [S] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ] [ ES ] = [ E ]·[ S ] k1/ (k-1+ k2) = [ E ]·[ S ] / KM 1/KM I EI E K-i [E] [I] = ki[ EI ] ki [ EI ] = Ki [E] [ I ] Ki :la constante de dissociation du complexe EI : [E]T = [E] + [ EI ] + [ ES ]

18 Ki KM KM [I] Ki [S] Ki x KM Ki Ki KM [E]T = [E] ( 1 + + ) [I] [S]
[E] [S] Ki KM [ EI ] = Ki [E] [ I ] [E]T = [E] ( ) [I] [S] Ki KM [E]T = [E] ( ) KM [I] Ki [S] Ki x KM KiKM

19 KM [I] Ki [S] Ki x KM KiKM Ki x KM + KM[I] + Ki [S] Ki [E]T = [E] ( )
[E] = Ki x KM + KM[I] + Ki [S] x [E]T Ki x KM

20 (Ki Ki x KM + KM [I] + Ki [S] k2 (Ki x KM + KM [I] + Ki [S]) KM ) ) KM
[E] = Ki x KM + KM [I] + Ki [S] x [E]T (Ki x KM ) Sachant que la vitesse de la réaction : = k2 [E] [S] KM Vi [ ES ] = [ E ]·[ S ] / KM Vi = K2 . [ ES ] On obtient donc : vi = x [E]T [S] k2 x (Ki (Ki x KM + KM [I] + Ki [S]) ) x KM KM

21 k2 Ki x KM + KM [I] + Ki [S] Ki KM (1 + ) + [S] Ki x Ki x [E]T [S]
vi = x [E]T [S] k2 x Ki Ki x KM + KM [I] + Ki [S] Ki Comme Vmax = k2 [E]T vi = Vmax [S] KM ( ) + [S] Ki [I] En présence d’inhibiteur : vi = Vmax [S] KM + Sans inhibiteur :

22 Inhibition compétitive
--1/Km -1/K’m l’affinité apparente diminue : K’M > KM ; 1/K’M < 1/KM Vmax = constante

23 IC50 inhibition compétitive
La valeur de IC50 : concentration d’inhibiteur nécessaire pour diminué la vitesse réactionnelle jusqu’à 50% de sa valeur maximale non inhibée IC50 s’approche de la valeur Ki aux très basses concentrations de substrat

24 Inhibiteur non compétitif : (fixation non exclusive)
les sites de fixation du substrat et de l'inhibiteur sont distincts. Les inhibiteurs non compétitifs n'ont pas d'homologie structurale avec le substrat. l'inhibiteur se fixe à l'enzyme libre E et au complexe ES ; de même, le substrat se fixe à l'enzyme libre E et au complexe EI. La fixation de I sur l’enzyme ne modifie pas Km. La fixation de S sur l’enzyme ne modifie pas Ki.

25 k1 k2 k-1 Ki S Ki Ki EIS KM KM S Ki [ ES ] = [ E ]·[ S ] / KM E + S ES
E + P k-1 [ E ] = [ E S]·[ Km ] / S I [ EI ] = Ki [E] [ I ] = S Ki [ES] [ Km [ I ] ] EI E [ ] [ ] [ ] I [ ESI ] = Ki [ES] [ I ] ESI ES S [ Km] = EIS [EI] [ S ] EIS= KM [EI] [ S] EIS EI [ ] [ ] EIS= KM [EI] [ S] = S Ki [ Km [ I ] S ] [ ] ) ( ) ([ES] [ ] [ ] [ ] [KM ] ES = [E]T – ([E] + EI +EIS ) V = K2 . ES [E]T = [E] + ES + EI +EIS

26 KM 1 Vmax [S] KM x vi = + vi = Vmax [S] + 1+ I /Ki 1
En présence d’inhibiteur non compétitive En absence d’inhibiteur : 1 Vmax [S] KM x vi = + vi = Vmax [S] KM + 1+ I /Ki 1 l’affinité n’est pas modifiée la Vmax diminue d’un facteur (

27 Inhibition non compétitive :
1/V’max 1/Vmax

28 IC50 pour inhibition non compétitive
Dans ce cas ,Ki représente la concentration d’inhibiteur nécessaire pour diminuer le Vmax par un moitie ce qui est identique à la définition de la CI50

29 Inhibition incompétitive : (fixation non exclusive) du terme anglo - saxon : "uncompetitive".
-l'enzyme et le substrat forment d'abord le complexe enzyme substrat (le complexe intermédiaire), puis l'inhibiteur se fixe à ce complexe , c’est une inhibition par blocage du complexe intermédiaire.

30 k1 k2 k-1 KM ESI Ki [ ] vi = Vmax [S] + [ ES ] = [ E ]·[ S ] / KM
E + P k-1 [ E ] = [ E S]·[ Km ] / S I [ Ki ] = ESI [ES] [ I ] [ ESI ] = Ki [ES] [ I ] = [E] [ S ] [ I ] ESI ES [ ] [Km] [ Ki ] [E]T = [E] + ES +ESI En présence d’inhibiteur En absence d’inhibiteur vi = Vmax [S] KM + Km et Vmax diminuent d’un facteur ( 1 / /Ki ) [ I ]

31 Inhibition incompétitive

32 IC50 inhibition incompétitive
Dans le cas ou l’inhibiteur se lie au complexe E-S : inhibition incompétitive La CI50 s’approche de la valeur de Ki aux très hautes concentrations de substrat

33 Représentation de Dixon:
Dixon a proposé une autre méthode pour déterminer la valeur de Ki en utilisant un graphique de 1/v en fonction de la concentration de l’inhibiteur I. Dans un graphique de Dixon , les droites déterminées à différentes concentrations de substrats se croisent à -Ki Inhibition compétitive :

34 Inhibition non compétitive
Inhibition incompétitive

35 Références: -ANTONIOTTI .S, cours de biocatalyse ,2007 -BECKER H ; Eléments de biochimie : Notions d’enzymologie -BENDAVID .C,2009, Enzymes et coenzymes -CHIBRAOUI Layachi et KABBACH Wafae, Enzymologie, -COLLAS .Ph : Enzymologie théorique -CORNISH-BOWDEN .A , JAMIN.M et SAKS.V , cinétique enzymatique ,2005DELAHAYE .A, Enzymologie, -KEILLOR.J.W, Inhibitions des réactions enzymatiques ,2004 Moussard.C , Biochimie structurale et métabolique, ed.de Boeck &Larcier s.a 2006 -PAPY –GARCIA.D et GARRIGUE ANTAR.L , Cinétique enzymatique -RAISONNIER .A, 2002,Enzymologie élémentaire -TOUSSAINT B., Les enzymes,2011 -WEINMAN .S et MEHUL.P , Toute la biochimie, ed. Dunod, Paris, 2004 Régulation de l’activité enzymatique :Allostérie et coopérativité Enzymologie; stratégie catalytique : –lariboisiere.weebly.com