Influence de la nanostructuration énergétique des substrats dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules neuronales modèles PC12 Guillaume Lamour.

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1 Influence de la nanostructuration énergétique des substrats dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules neuronales modèles PC12 Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010 Soutenance de thèse

2 Différenciation neuronale : processus suivant lequel une cellule acquiert un phénotype neuronal 2

3 Différenciation neuronale et adhésion cellulaire :  Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?  Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? Différenciation neuronale et adhésion cellulaire :  Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?  Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? Différenciation neuronale et adhésion cellulaire :  Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?  Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? neurite corps cellulaire (soma) noyau Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] cône de croissance 3

4 Le cône de croissance : structure et fonctions chimio-répulsionchimio-attraction microtubule filament d’actine faisceau de filaments d’actine filopode lamellipode axone cône de croissance 4

5 Propriétés de surface des biomatériaux :  La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ?  Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Propriétés de surface des biomatériaux :  La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ?  Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Propriétés de surface des biomatériaux :  La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ?  Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ? Interactions [neurones/surfaces biocompatibles] Adhésion cellulaire et différenciation neuronale :  Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?  Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ? Distribution de l’énergie de surface ? 1 µm ΔEΔE Deux paramètres : Nanorugosité Gradients locaux surface E3E3 E1E1 E2E2 E4E4 E5E5 5

6 Partie I Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la neuritogénèse 6

7 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 7

8 Technique de modification du verre 8

9 Stratégies de modification du verre par diverses molécules PLL n EDA 9

10 Les cellules PC12 :  sont dérivées d’un phéochromocytome de rat.  voient leur cycle cellulaire stoppé et se différencient sous traitement au NGF. Cellule PC12 - 6 jours Cellules PC12 - à l’ensemencement Les cellules PC12 :  sont dérivées d’un phéochromocytome de rat. Cellule PC12 NGF 6 jours Cellules PC12 : modèle d’étude pour la différenciation neuronale 10

11 Neuritogénèse des cellules PC12 sous l’effet d’un traitement au NGF sans NGF 6 jours avec NGF 6 jours 11

12 6 jours verre/EDA Sur PLL :Sur EDA : Neuritogénèse induite par effet de surface sans NGF 6 jours 12 Gradients locaux dans les énergies d’adhésion

13 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 13

14 Expression du marqueur neuronal : MAP1B 14

15 verre/PLL sans NGF témoin négatif verre/PLL avec NGF témoin positif verre/EDA sans NGF Immunomarquage de MAP1B (après 6 jours de culture) 15

16 avec NGF 50 µm sans NGF PEDA : 6 jours PEDA : 6 jours (sans NGF) Expression du marqueur neuronal : Tau 50 µm25 µm 50 µm actine Tau ADN 16

17 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 17

18 CH 3 NH 2 NH 3 + NH 2 Influence de la nature des terminaisons Biopolymères (acides aminés)Alkylsiloxanes peu ou pas de neuritogénèseneuritogénèse élevée PLLEDA PLOHTMS 18

19 PLL EDA HTMS PLO Microscopie interférentielle (RICM) temps accéléré (× 50) 10 µm 19

20 Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères Conditions de culture pas optimales Multiplicité des paramètres : mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité chimique  Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques Conclusions  Influence de facteurs externes Limites Neuritogénèse obtenue par effet de surface Expression de marqueurs neuronaux  Influence de gradients locaux dans les énergies d’adhésion  Reproduction de l’effet du NGF 20

21 Partie II Identification des paramètres de surfaces critiques à la réponse cellulaire 21

22 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 22

23 Modification du verre par auto-assemblage d’alkylsiloxanes très ordonnée conformation all-trans Classe 1 partiellement ordonnée perte des liaisons latérales Classe 2 très désordonnée hétérogénéité chimique accrue Classe 3 23

24 Spectroscopie vibrationnelle :  génération de fréquence somme (SFG) Techniques de caractérisation des surfaces modifiées Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : substrat État vibrationnel excité ω IR ω Vis ω SFG État fondamental État virtuel  modèle Owens-Wendt composantes dispersive/apolaire énergie d’adhésion solide-liquide composantes non-dispersive/polaire 24

25 Comparaison IRTF / SFG sur le spectre vibrationnel d’une monocouche d’OTS (région C-H) 25

26 Spectres SFG des substrats dans la région C-H ODMS 1 ; ODMS 2 ; HTMS M :  Formation d’une monocouche désordonnée Classe 2 & Classe 3 OTS (θ = 110°) ODMS 1 (θ = 77°) HTMS H (θ = 104°) HTMS M (θ = 56°) ODMS 2 (θ = 96°) Classe 1 OTS ; HTMS H :  Formation d’une monocouche très ordonnée 26

27  modèle Owens-Wendt Techniques de caractérisation des surfaces modifiées Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides : Spectroscopie vibrationnelle :  génération de fréquence somme (SFG) composantes dispersive/apolaire énergie d’adhésion solide-liquide composantes non-dispersive/polaire substrat État vibrationnel excité ω IR ω Vis ω SFG État fondamental État virtuel 27

28 Estimation des énergies libres de surface Classe 2 (▲) :  présence de gradients locaux dans les E adhésion Classe 3 (#) :  hétérogénéités chimiques accrues 28 Classe 1 (¤) :  Distribution homogène de l’énergie (  s ≈  d )

29 pas d’adhésion  agrégats cellulaires flottant adhésion limitée  quelques neurites 200 µm Adhésion limitée sur le verre propre (les cellules tendent à se détacher) Adhésion et neuritogénèse des PC12 sur 3 classes de surfaces après 48h de culture sans NGF 200 µm classe 1classe 2classe 3 adhésion renforcée  forte croissance neuritique surface très ordonnéesurface (dés)ordonnéesurface très désordonnée 29

30 Identification du facteur critique :  hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques E adhésion (classe 3) > E adhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γ s ? Identification du facteur critique :  hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques E adhésion (classe 3) > E adhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γ s ? Conclusions 30

31 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 31

32 Modification du verre par des aminosilanes Classe 2Classe ??? État ordonné État désordonné ADMSAPTMSEDA DETAPEDA Monométhoxy-silaneTriméthoxy-silanes 32

33 EDAPEDA ADMSAPTMS eda & peda :  très hétérogènes (Classe 3) adms & aptms :  plus homogènes (Classe 2) deta :??? Analyses des surfaces NH 2 : théorie de Zisman Liquides tests énergies critiques γ c ± 2 mN m -1 33

34 ADMSAPTMS Analyses des surfaces NH 2 : théorie de Owens – Wendt Liquides tests énergies critiques γ c 34 eda & peda :  très hétérogènes (Classe 3) adms & aptms :  plus homogènes (Classe 2) deta :??? ± 2 mN m -1

35 Cellules en culture sur les surfaces NH 2 /OH après 24h de culture sans NGF classe 2 différenciation : + cas particulier du deta classe 2 classe 3 différenciation : ++++ 35

36 La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH 2 /OH et les surfaces CH 3 /OH. L’intensité de la tension de surface totale γ s n’est pas critique. Sur des surfaces homogènes (CH 3, NH 2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, et la différenciation n’est pas stimulée. Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH 2 /OH ou CH 3 /OH) produisant l’hétérogénéité, et la différenciation est fortement stimulée. La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH 2 /OH et les surfaces CH 3 /OH. L’intensité de la tension de surface totale γ s n’est pas critique. Sur des surfaces homogènes (CH 3, NH 2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, et la différenciation n’est pas stimulée. Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH 2 /OH ou CH 3 /OH) produisant l’hétérogénéité, et la différenciation est fortement stimulée. La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH 2 /OH et les surfaces CH 3 /OH. L’intensité de la tension de surface totale γ s n’est pas critique. Sur des surfaces homogènes (CH 3, NH 2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le degré d’affinité chimique des cellules au substrat, et la différenciation n’est pas stimulée. Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de groupes chimiques (NH 2 /OH ou CH 3 /OH) produisant l’hétérogénéité, et la différenciation est fortement stimulée. Conclusions 36

37 Plan de l’exposé Introduction Partie I Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse  Stratégies de modification des surfaces de verre  Caractérisation de l’état de différenciation  Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat Partie II Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH 3 »  Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH 2 »  Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule Conclusion 37

38 AFM : cellules PC12 sur verre/EDA. 150 nm 38

39 Déstabilisation du cytosquelette d’actine par la cytochalasine-B. témoin [cytochalasine] = 5 µM 39

40 Conclusion générale. Influence de la distribution des énergies d’adhésion sur la différenciation neuronale  Mise en évidence de l’impact de gradients locaux Redéfinition des monocouches auto-assemblées en qualité de substrat d’adhésion selon la distribution des énergies de surfaces qu’elles exposent  Classe 1 : très ordonnée Classe 2 : relativement (dés)ordonnée Classe 3 : très désordonnée Nécessité de combiner SFG et Owens – Wendt  Assignation des substrats élaborés aux classes définies Mise en évidence de l’influence des hétérogénéités chimiques locales du substrat dans les processus d’adhésion et de différenciation neuronale des cellules PC12 40

41  Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ?  Investigation de la dynamique des filaments d’actine  A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ?  Création de gradients contrôlés via des nanoplots  Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca 2+  Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ?  Investigation de la dynamique des filaments d’actine  A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ?  Création de gradients contrôlés via des nanoplots  Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca 2+  Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ?  Investigation de la dynamique des filaments d’actine  A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ?  Création de gradients contrôlés via des nanoplots  Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca 2+  Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies d’adhésion ?  Investigation de la dynamique des filaments d’actine  A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la réponse cellulaire ?  Création de gradients contrôlés via des nanoplots  Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?  Examen du rôle éventuel de l’ion Ca 2+ Perspectives 41

42 Conclusion générale. Distribution de l’énergie de surface Distribution de l’énergie de surface ? 42