Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009

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1 Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009
Laboratoire & allergologie Nouvelles applications Parler de : BAT pour avoir confirmation d’un IgEs pos et Test cutané Neg ImmunoCAP ISAC peu de serum et bcp d’informations Allergènes recombinants : etude didier ebo Allergies alimentaires et leur evolution Nos tests au CHU noisette cacahuète Nutella Société Liégeoise de Dermatologie Phn. Biol. E. Cavalier Phn Romy Gadisseur 17/12/2009

2 Ligne du temps… diagnostic de l’allergie.
Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009 Ligne du temps… diagnostic de l’allergie. Standardisation des extraits allergéniques Panels d’allergènes recombinants mimant des extraits allergéniques Caractérisation & désignation des IgE ImmunoCAP ISAC (Phadia/ VBC Genomics) 1ers allergènes clonés Tests de Provocation (SPT) Premier ”allergen microarray” RAST 1880 1967 2000 2008 Simplified overview of the historical development of allergy diagnosis and treatment. Tests IN-VIVO Tests IN-VITRO Component – Resolved -Diagnostics

3 Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs (I)
Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009 Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs (I) Hypersensibilité de type 1 (H. immédiate, allergie réaginique ou atopique) : Immunité humorale = Allergie. Médiée par les IgE spécifiques d’un allergène (IgE dépendante). Tendance héréditaire. Manifestations cliniques diverses (dermatite allergique, rhinite pollinique choc anaphylactique, asthme, rhinite, conjonctivite, urticaire, troubles digestifs, eczéma…) Apparaissent en quelques minutes. Les IgEs fixées sur les mastocytes tissulaires et sur les basophiles sanguins, réagissent avec l’Ag (allergène), induisant ainsi la dégranulation de ces cellules (libération d’histamine et d’autres médiateurs). 1975 Médiée par les IgE spécifiques d’un allergène Manifestations cliniques diverses eczema, anaphylaxie, asthme L'allergie est un phénomène qui s'amplifie au cours des stimulus, surtout en l'absence de traitement et/ou prévention, provoquant: - des manifestations cliniques de plus en plus sévères (aggravation des signes, pouvant aller jusqu'à un choc A en ce qui concerne l'HS1). - une augmentation progressive du nombre d'allergènes auquel l'individu réagit (poly-sensibilisation), surtout chez un individu atopique. Il est important de sensibiliser le propriétaire d'un animal à cet aspect, car plus la prise en charge est précoce, plus elle est efficace. Une caractéristique principale de l'HS est son caractère individuel: seuls certains individus développeront une HS (alors que la majorité des individus soumis au même problème ne développeront pas d'allergie ou de complication). 2 raisons peuvent l'expliquer: - les conditions d'apparition d'une HS lors de stimulations antigéniques répétées sont complexes et mal connues (dose antigénique, durée et nombre de contacts, facteurs favorisants???): un grand nombre de mécanismes immuns sont modifiés au cours de l'HS sans qu'il soit facile de faire la part des choses (production de nombreuses cytokines, activation de sous-types lymphocytaires..). Une prédisposition génétique à développer certains types de réponse immune a été observée en particulier dans le cas de l'HS1 (atopie).

4 Recombinants : Production

5 Components - Resolved Diagnosis (CRD)
Component-Resolved Diagnosis uses defined recombinant allergens to dissect the individual patient’s IgE reactivity profile with the aim of identifying the disease-eliciting molecules. Valenta R et al, Clin Exp Allergy 1999 Molecules, genuine markers tell you the truth ! Mari A., VIP Customers day, Brussels, 17th November 2009. La présence d’IgE pour des composants allergéniques qui peuvent occasionner des réactions croisées peut être mesurée et permet d’estimer une sensibilisation pertinente cliniquement à d’autres sources qui contiennent des allergènes proches au niveau de la structure et au niveau de leur activité immunologique.

6 IgE « spécifiques » pour un extrait
Du point de vue du laboratoire… Que veut dire un taux d’IgEs pour un extrait allergénique ? Que faire de ce résultat ? Qu’en est-il des soins pour le patient ? Qu’en est-il du risque pour le patient ? Y a-t-il un intérêt à réaliser du Component-resolved diagnosis en routine dans notre laboratoire? Comment peut-on réaliser du CRD dans notre labo? Impact sur le suivi du patient et sa santé (appréciation de la sévérité, risques, choix thérapeutiques, amélioration de la qualité de vie du patient). Notre expérience avec la sensibilisation à l’arachide… + IgEs pour f13, anamnèse, recombinants Question :”Doit-on recommander une éviction stricte de l’arachide ?”

7 Exemple Arachis Hypogea
Allergénicité : Ara h 2 est un allergène 100 fois plus puissant que Ara h 1 Koppelman SJ et al, Clin Exp Allergy 2004,34:583 Ara h 2 possède un haute stabilité protéolytique Lehmann K et al, Biochem J, 2006: Après rôtissage de l’arachide, l’allergénicité d’Ara h 2 est multipliée par 3 Maleki SJ et al, J Allergy Clin Immunol, 2003 Ara h 1 : Protéine de stockage (vicilline) allergène majeur, stabilité à la digestion et chaleur. Ara h 2 : Protéine de stockage (conglutine) +fréquent, potentiel de sensibilisation ++, stabilité à la digestion ++. Réactions sévères >> systémiques ! Ara h 3 : Protéines de stockage (glycinine) allergène mineur, rares sensibilisations. Ara h 8 : PR-10 (Bet v 1 homologue) allergènes majeurs de l’arachide chez les patients allergiques au pollen de bouleau. Sensible à la chaleur et à la digestion. Ara h 9 : nsLTP Très stable à la chaleur et à la digestion. Réactions sévères >> réactions systémiques ! Ara h 8 : Profiline Réactions croisées entre de nombreux fruits et végétaux de différentes classes botaniques. CCD (MUXF3) Cross-reactive Carbohydrate Determinants Rarement associés à des symptômes. Glyco-épitopes présents dans la majorité des plantes.

8 Du point de vue du laboratoire : Comment contribuer à diagnostiquer une allergie à l’arachide ?
Arachide (f13) + Ara h 2 (f423) Arachide (f13) : Nég Ara h 2 : Nég Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Nég Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Pos Peu de risque de réactions sévères Risques de réaction sévère? Très haut risque de réaction sévère Comment explorer? Recommendations Comment explorer ? Recommendations Test : Risque Ara h 1 (f422) Ara h 3 (f424) Ara h 9 (f427) Ara h 8 (f352) CCD (Ro214) Bouleau (Nord de l’Europe) : test Ara h 8 (f352)

9 Si nous suivons la même démarche, grâce à tous les recombinants,
Plus complexe… Julien, B (18 ans): Cas clinique complexe !! Atopie, Dermatite atopique, Rhinite perannuelle, Eczema géant. Allergie alimentaire (blanc d’oeuf, arachide, soja, crabe et ail) Comment expliquer les symptômes ? SPT Pneumallergènes: + : D1 et D2, chien, graminées. Douteux : bouleau. SPT Trophallergènes : + Blanc d’oeuf, arachide, soja, ail. Si nous suivons la même démarche, grâce à tous les recombinants, on pourrait tout expliquer !! IgEs pour extraits Arachide,f13 9.71 Soja,f14 4.43 Crabe,f23 1.98 Ail,f47 4.11 Blanc d’oeuf,f75 0.61 Pityrosporum orbiculare,m70 3.93 Dermatophagoïdes pteronyssinus,d1 >10 Blanc d’oeuf,f1 5.37 Crevette ,f24 2.64 Gx3:g1+g5+g6+g12+g13 93.6 Bouleau,t3 58.0

10 En théorie, c’est possible…
Request form ImmunoCAP™Components Patient: Nom : B. Julien Adresse: Rue des bouleaux 1… Some other components less useful in Belgium could be available. Don’t hesitate to ask to your Lab in case of specific clinical history. June 2009 En théorie, c’est possible… En pratique, … Docteur: Nom: Cavalier Etienne Adresse : CHU de Liège Date de demande: 19/11/2009 Signature:

11 ImmunoCAP© ISAC Fruit de l’association des firmes Phadia (expert des tests diagnostic in-vitro) et VBC Génomics (expert en microarrays) : L’« ImmunoCAP ISAC ». Alliance de la recherche dans le domaine de l’allergologie moléculaire et de l’innovante technologie des biochips. Harwanegg C et al, Expert Rev Mol Diagn 2004 Multiplex moderne utilisé comme outil supplémentaire pour le diagnostic in-vitro, par les allergologue et spécialistes, basé exclusivement sur les composants allergéniques. Plateforme miniaturisée d’immunoessais pour la mesure des IgEs dirigés contre >40 sources allergéniques communes, en un seul dosage. Biopuce composée de 103 allergènes natifs et recombinants immobilisés sur une support solide. Allergènes choisis en fonction de leur pertinence dans l’établissement d’un profil de sensibilisation. Tests sur 20 μL de sérum ou sang total. Permet de réaliser du CRD rapidement et à moindre coût.

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Triplet d’allergènes après réaction fluorescente Immuno Solid-phase AllergenChip (ISAC) Molécule allergénique Anticorps secondaire anti IgE humain couplé à une molécule de fluorescence ImmunoCAP ISAC version 103 sera remplacé en juin 2010 par version 125 (> 20 allergènes différents ajoutés) Anticorps IgE (dans le sérum du patient) The allergen biochip is a solid substrate built from a glass plate that is chemically altered to retain allergenic protein molecules in a biologically active form. Picolitre quantities of each allergen preparation are deposited on spatially separate locations on the biochip. The resulting addressable microarray allows for many biological affinity reactions to be monitored in parallel (=multiplexing). In a single analytical step, the comprehensive allergen sensitization profile of a patient can be measured using only a minute amount of serum or plasma; this is followed by automatic readout and report generation. The present chip used for in vitro diagnostics incorporates 103 allergens from about 50 different allergen sources. 4 sites de réaction

13 B. Julien (18 ans) Bet v 1 homologues (PR-10):
Bet v 1, Aln g 1, Cor a 1, Mal d 1, Pru p 1, Gly m 4, Ara h 8, Api g 1 Marqueurs d’espèce : Gal d 1, Bos d lactoferrine, Fel d 1, Fel d 4, Can f 1, Mus m 1, Alt a 1 Profilines : Bet v 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 1, Phl p 12 Der p 1, Der f 1, Der f 2, Der p 2, Eur m 2 Pollens : Cyn d 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6 et Ole e 1 Grâce au CRD, nous trouvons des explications : Nombreuses allergies alimentaires dues à la sensibilisation aux profilines, protéines PR-10 (OAS), tropomyosine (fruit de mer), lait de vache… Nombreuses graminées, acariens, animaux domestiques… qui expliquent la rhinite perannuelle exacerbée durant le période pollinique. Tropomyosine : Der p 10

14 Autres nouveaux tests en allergologie
Lorsque le diagnostic in-vitro est indisponible via les moyens usuels (dosage d’IgEs) : Médicaments (AB, AINS, curarisants, …), Additifs alimentaires, Colorants, Conservateurs, Excipients. Dans le cas de discordances entre anamnèse clinique et résultats biologiques. Lorsque les résultats des tests in-vivo sont ininterprétables, ou irréalisables : Enfants Si risque ++ En cas de refus du patient de prendre un risque… Pensez aux tests de provocations in-vitro : CAST (Cellular Antigen Stimulation Test) BAT (Basophil Activation Test)

15 CAST / BAT Intérêt dans la clinique en routine.
Nouvelles approches scientifiquement séduisantes qui permettent d’explorer le mécanisme physiopathologique des réactions allergiques et d'intolérance et ce, au niveau cellulaire. Sans danger pour le patient, ces tests de provocation in-vitro permettent d'explorer les réactions allergiques IgE-dépendantes. Le concept de ces tests est de mimer in-vitro le contact entre l’allergène et les cellules qui vont générer les symptômes. Il permettent non seulement d'objectiver mais aussi de quantifier la réactivité des leucocytes par : Dosage quantitatif des sulfidoleucotriènes qu'ils sécrètent en réponse à une stimulation antigénique (CAST). Évaluation du pourcentage des basophiles activés via l’expression du marqueur CD63 de la membrane des basophiles activés (BAT). Techniques robustes sur lesquelles on peut compter pour le diagnostic in-vitro des allergies immédiates et ce, en complément d’autres tests in-vitro déjà existants. Intérêt dans la clinique en routine. Mais : Nécessité d’une standardisation (seuil de décision clinique, dilutions des allergènes) Chaque allergène doit être étudié et testé un par un afin de déterminer la concentration optimale

16 A. Cellular Antigen Stimulation Test - CAST -
Test de provocation in-vitro. S’effectue sur du sang frais (cellules vivantes) endéans les 4h. Test ELISA (immuno-essai). Il permet d'objectiver et de quantifier la réactivité des leucocytes par dosage quantitatif des sulfidoleucotriènes qu'ils sécrètent en réponse à une stimulation antigénique. Les leucotriènes (LT) sont des médiateurs puissants de la réaction allergique et participent à la genèse des manifestations cliniques de type asthme, rhinoconjonctivite, urticaire, oedème angiomateux et choc anaphylactique. Intérêt dans le diagnostic des allergies : Alimentaires Au latex Aux venins d’insectes MAIS SURTOUT : Aux médicaments Antibiotiques, aspirine, AINS.

17 B. Basophil Activation Test - BAT -
La cytométrie de flux est un outil intéressant pour l’analyse des différents types de cellules et permet d’identifier des populations cellulaires spécifiques, même dans le cas des populations présentes en petit nombre. La technique semble idéale pour étudier la dégranulation des basophiles induite par l’allergène. L’identification des cellules est basée initialement sur l’expression du CD45 (antigène présent à la surface de leucocytes) et sur la présence d’IgE à la surface cellulaire. Les basophiles expriment le récepteur de haute affinité pour les IgE (FcεRI). Dans cette population définie, l’activation des cellules après avoir été mises en contact avec l’allergène est déterminée par l’expression du marqueur CD63 de la membrane. CD63 est ancré dans la membrane des granules du basophile (contenant l’histamine) et son expression sur la partie externe de la cellule reflète la dégranulation cellulaire et la fusion des granules et la membrane plasmatique. L’expression du CD63 a été proposé comme un excellent moyen de monitorer l’activation des basophiles. Boumiza R , Clinical and Molecular Allergy 2005, 3:9

18 Basophil Activation Test - BAT -
Intérêt dans le diagnostic des allergies : Alimentaires (blanc d’œuf, arachide…) Au latex Aux venins d’insectes Aux médicaments Curarisants, antibiotiques, AINS, Pour les curarisants les résultats en BAT sont parfaitement comparables au CAST… Donc le CAST (moins onéreux) est recommandé… Sensibilité comparable aux IgEs. S’effectue sur du sang frais (cellules vivantes) endéans les 4h. Permet de suivre l’efficacité de l’Immunothérapie spécifique. Cette technologie a plus de potentiel que d’embûches et les résultats fournis par cette technique sont utiles dans plusieurs situations malgré le fait que chaque laboratoire ait son propre protocole. D. Ebo, Clinical & Experimental Allergy, 39 : 1115–1116 María L. Sanz et al,Drug Hypersensitivity. Basel, Karger, 2007, pp 391–402

19 ImmunoCAP Tryptase La Tryptase est la protéine la plus abondante des mastocytes. La Pro-β-tryptase est sécrétée de manière constitutive tandis que la β-tryptase mature reflète l’activation des mastocytes. Le taux basal de protryptase donne une idée du nombre de mastocytes. Un taux élevé de β-tryptase mature indique une activation des mastocytes. ImmunoCAP Tryptase permet de mesurer la tryptase totale (α-tryptase + β-tryptase) Un taux de tryptase sérique (pro-β + pro-α + β-tryptase mature) élevé indique une dégranulation des mastocytes, comme dans les réactions anaphylactiques. Utilité clinique : Anaphylaxie Taux élevé transitoire confirme l’activation des mastocytes utile pour un diagnostic post mortem Marqueur de risque de réaction sévère Un taux basal élevé indique une augmentation du risque de réaction sévère dans l’allergie aux venins et médicamenteuse Avant et pendant l’IT pour venins (ImmunoThérapie spécifique)

20 ImmunoCAP Tryptase Timing pour la collecte d’échantillons :
1er échantillon : dans l’intervalle 15min-3h après l’apparition des symptômes. 2nd échantillon : après 24-48h, afin de confirmer le retour au taux basal. 3ème échantillon : après 1-2 semaines si suspicion de mastocytose

21 Western Blot Pour certains cas complexes d’allergie,
Lorsque le CRD et les IgEs pour les allergènes recombinants existants sur le marché ne permettent pas d’expliquer une réactivité aux Prick tests ou un dosage d’IgEs positif pour un extrait allergénique, Lorsqu’il y a néanmoins une histoire clinique pertinente… Il est possible de tenter la mise en évidence de la protéine responsable par réalisation d’un Western Blot…

22 En résumé La route de la découverte des profils de sensibilisation est tracée… Les extraits allergéniques sont utiles : En première intention, Ne permet pas de conclure dans tous les cas (multiple positivités des tests, manque de précision), IgEs pour les extraits pas toujours significatifs. Échecs de désensibilisation Ne permettent pas d’évaluer la sévérité des réactions allergiques Contribuent parfois à des régimes d’éviction trop larges… Le CRD est entre nos mains. Sensibilisations peuvent causer des erreurs de diagnostic (et erreurs thérapeutiques également). Familles de protéines décrites, similarités de structure (homologie de chaînes d’acides-aminés ou homologie de structure) Allergie à une seule protéine peut causer des réactions croisées à d’autres protéines de la même famille. Allergènes recombinants permettent de se focaliser sur un (ou plusieurs) allergène(s) d’une source : Disponibilité en CAP (et/ou en ISAC) ou en cours de développement…

23 En résumé Les microarrays peuvent nous être profitables, dans des cas difficiles : 103 recombinants or allergènes naturels purifiés en une seule détermination… Validation analytique de l’ImmunoCAP© ISAC : Concordance : 86% (résultats négatifs) et 94% (résultats positifs) L’ImmunoCAP© ISAC a un rôle à jouer dans le diagnostic et le soin aux patients avec des profils de sensibilisation complexes. Comme cette technique génère potentiellement des résultats inattendus, la réalisation et l’interprétation d’un microarray doivent être évalués en parallèle avec la clinique du patient. Interprétation des résultats difficile : Destiné aux spécialistes ! Nous sommes là pour vous aider…

24 En résumé L’ImmunoCAP ISAC est un outil de choix pour évaluer le profil de sensibilisation d’un patient : Polysensibilisé, atopique Dont l’anamnèse n’est pas très claire Dont les prick tests donnent beaucoup de positivités. L’ImmunoCAP ISAC permet de travailler sur une quantité MINIME de sérum (20µL) et de gagner du temps (et finalement de l’argent). La technique permet d’éviter les régimes d’éviction trop larges et d’améliorer le confort de vie du patient allergique/atopique… Intérêt en pédiatrie…

25 En résumé Les tests de BAT et de CAST ne sont pas à utiliser en première intention. Ils sont complémentaires aux tests cutanés et IgEs. Intérêt particulier quand ces tests ne peuvent être réalisés ou aboutissent à des résultats douteux en comparaison avec l’anamnèse clinique. Le dosage de tryptase Un taux basal élevé indique une augmentation du risque de réaction sévère dans l’allergie aux venins et médicamenteuse Avant et pendant l’IT pour venins (ImmunoThérapie spécifique) Les Western Blot peuvent apporter une aide au diagnostic mais nécessite encore un travail important de la part du laboratoire…

26 Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009
Merci pour votre attention !!