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Publié parGautier Piquet Modifié depuis plus de 9 années
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May, 12th 2007 Pierre ABADIE – ENS of Cachan INRA Bordeaux-Aquitaine, UMR Santé Végétale
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Oomycota family (brown algae) Biotrophic parasite, introduced in France in 1878
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Since 1996, massive use of the fungicide famoxadone Consequence: resistant pathogen strains of Plasmopara viticola quickly emerged Resistance to famoxadone is due to a punctual mutation (G143A) in the mitochondrial gene coding the cytochrome b General goal: acquire data on spreading and maintainance of P. viticola resistant strains, in the optif of improving fungicides application management. My training period goal: studying fitness of resistant and sensitive strains to famoxadone -> Is there a cost of resistance?
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Fitness = succès reproductif, capacité à survivre et à se multiplier Mesure d’un indice de fitness = produit de plusieurs paramètres expérimentaux
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Goal: following the evolution of sensitive/resistant strains proportions during 8 cycles 5 couples R/S 3 initial mixes - 20%R 80%S - 50%R 50%S - 80%R 20%S Cycle 0Cycle 1 5 couples R/S 3 mixes - ?%R ?%S Reinoculation on leaves (1 week) FUNGICIDE CRIBLE (1 week) Visual notation to estimate resistant and sensitive percentages QUANTITATIVE PCR To estimate resistant and sensitive percentages Cycle 8
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INOCULATION ON LEAVES Inoculation of 24 drips of 15µL, adjusted to 40,000 sporangias/mL One week at 22°C Sporulation
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THE FUNGICIDE CRIBLE Inoculation on leaves disks sprayed with famoxadone (100mg/mL) Visual notation
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ENSEMBLE DU TEST DE COMPETITIVITE
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PREMIERS RESULTATS
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MESURES PAR PCR QUANTITATIVE Objectif: déterminer le % de résistants et de sensibles dans les mélanges du test de compétitivité afin de réaliser un suivi au cours des semaines (= complément des mesures du crible fongicide) Etat d’avancement: mise au point de la méthode en cours, en attente des premiers résultats… Protocole: Utilisation de la sonde fluorescente « Sybr-green » Extraction d’ADN de suspensions de sporanges réalisées à partir des 4 feuilles contaminées pour chaque mélange Utilisation d’un couple d’amorces non spécifique R/S et d’un couple d’amorce spécifique R ciblant la mutation G143A du gène mitochondrial bc1 30 cycles d’amplification
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MESURES PAR PCR QUANTITATIVE (5’) 1021 TTATGCGTGATGTAAATAACGGTTGGTTAATTCGATATATACATGCGAATGGTGCATCTT 1081 TTTTTTTTATTGTTGTATATATACATATTTTTAGGGGTTTGTATTACGGATCTTATATTA 1141 CACCTAGAGAAGCTTTATGGTGTTCAGGGGTAATTATTTTTATTTTAATGATGGCGACTG 1201 CATTTATGGGTTATGTTTTGCCTTGGGGACAAATGAGTTTTTGGG G TGCAACAGTTATTA 1261 CAAATTTATTCTCGGCTATCCCATTAATTGGAAAAGAAGTTGTTGACTGGTTATGGGGTG 1321 GATTCGCCGTTGATAATCCAACATTAAATCGTTTTTTTAGTTTACATTTCACCTTTCCAT 1381 TTGTAATTGTAGGGGCTGTACTAATACATTTAATTTTATTACATGAGGTAGGTTCAAATA (3’) : SNP G143A conférant le phénoptype résistant : amorces non spécifiques amplifiant R et S : amorces spécifiques amplifiant uniquement les R G
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PERSPECTIVES Poursuivre le test de compétitivité jusqu’à 8 cycles Réaliser les mesures par PCR-Q Réaliser un modèle d’évolution des souches R et S en fonction des paramètres de fitness (utilisation du logiciel Stella) Analyser les données afin de déterminer si oui ou non la résistance implique un coût pour le champignon en absence de fongicide
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