Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4: recherche des kinases responsables de la phosphorylation de la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces.

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1 Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4: recherche des kinases responsables de la phosphorylation de la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae Présenté par Olivier DELORME Sous la direction de MM. François DOIGNON et Didier THORAVAL Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2

2 Le cycle de régulation des protéines Rho3 et Rho4
GDP GTP Rgd1 GEF Forme active Forme inactive Pi

3 La protéine Rgd1 (Related GAP Domain 1)
FCH RhoGAP Fes-CIP4 Homology Coiled-coil Rho GTPase Activating Protein  D’après Roumanie et al., 2000

4 La protéine Rgd1 est phosphorylée
H. Fernandes.2005

5 Où se trouvent les sites de phosphorylation ?

6 La phosphorylation régule l’activité de Rgd1p
H. Fernandes. 2005 L’activité RhoGAP augmente lorsque Rgd1 est sous forme non phosphorylée

7 Quels sont les mécanismes qui régulent Rgd1p ?
Phosphatases? Rho3 Rgd1 Rho4 Kinases?

8 Objectifs Participation à l’étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4 Etude de la régulation de Rgd1p Recherche des kinases

9 Recherche des kinases de Rgd1p
Approche ciblée : Analyse des souches mutées pour les gènes codant pour les kinases potentielles de Rgd1p Approche globale: Analyse des souches mutées pour les gènes codant pour les kinases Approche par la protéomique : le Proto-Array

10 Approche ciblée : les kinases potentielles
Rgd1p Mkk2p Bck1p Mkk2p et Bck1p Complexe protéique Activité AMPc dépendante, la quantité d’AMPc varie au cours de la croissance PKA (Tpk1, Tpk2, Tpk3) Ipl1 Aurora B ? Ipl1p Rgd1p GAP GAP MgcRacGAPp

11 Prélèvement des cellules
Stratégie d’analyse Extraction Protéines totales Western Blot Prélèvement des cellules Détection et Quantification par caméra CCD Détection des bandes présentes sur la membrane Acquisition d’une image Acquisition des valeurs d’intensité des bandes Calculs des rapports P/nP pour chaque extrait et détermination du seuil

12 Méthode de calcul Seuil=(moyenne)-(écart-type)
WT rgd1Δ 1Δ 2Δ 3Δ 4Δ 5Δ 6Δ P nP P/nP Moyenne P/nP Ecart-type Seuil=(moyenne)-(écart-type) P/nP<Seuil => la souche est sélectionnée

13 Approche Ciblée Seuil Valeur P/nP Extraits protéiques WT mkk2Δ WT WT
3,3 3 2,9 2,5 2,4 2,2 2,1 1,9 Seuil 1,8 1,7 1,2 Extraits protéiques 1 tpk1Δ, tpk2Δ, tpk3Δ WT mkk2Δ WT WT WT WT bck1Δ ipl1-322 ipl1-322

14 Approche globale Seuil Valeur P/nP 6,5 3 2,5 2 1,5 1
Extraits protéiques ymr291wΔ 1 Valeur P/nP 2 3 2,5 1,5 6,5 WT2 WT4 WT1 WT3 WT5 ypl236cΔ ypk2Δ ynr047wΔ yak1Δ ypk1Δ ydl025cΔ ssk1Δ ygr052cΔ yck2Δ ste7Δ yil042cΔ rgd1Δ Seuil

15 Approche globale

16 Quelles sont les kinases retenues?
Yck1p, Yck2p Endocytose, cytocinèse Mécanismes du cycle cellulaire Bub1p, Fus3p, Pho85p Sélection du site de bourgeonnement Bud32p Dig1p, Tpk3p Croissance invasive Régulation de l’ARN polymérase II Ssn8p Régulation des mécanismes de réparation de l’ADN Mck1p, Dun1p

17 L’analyse des souches mutées par Western Blot est elle suffisante ?
Le crible permet de sélectionner les kinases candidates Il est impossible de déterminer les kinases qui interagissent physiquement avec Rgd1p

18 Recherche des kinases en utilisant le proto-array
Rgd1 V5 6xHis Protéine de fusion purifiée Utilisation Anticorps Anti-V5 fluorescent Incubation des protéines de fusion sur la puce Puce Invitrogen™  contenant 4088 protéines de S. cerevisiæ (70% des protéines totales) Localisation des protéines qui interagissent avec Rgd1p

19 Comment obtenir la protéine de fusion ?
Amplification de la séquence codante de RGD1 Clonage du produit de PCR dans un vecteur navette Transformation de bactérie avec le vecteur contenant la séquence codante Production du vecteur dans la bactérie, puis transformation des levures avec le vecteur Purification de la protéine de fusion

20 Le vecteur utilisé pour effectuer la construction
Invitrogen

21 Conclusions générales
Le crible des kinases ciblées a permis de sélectionner Ipl1 A partir des 140 protéines testées, 11 kinases ont été retenues. Parmi ces 11 kinases Yck1, Yck2, Bud1 et Fus3 sont les meilleures candidates La construction plasmidique contenant la séquence codante fusionnée aux étiquettes V5 et 6xHis a été effectuée

22 Perspectives A court terme : A long terme :
Terminer l’approche par le proto-array Effectuer des tests d’activité sur les 11 kinases retenues A long terme : Étudier les kinases et leur implication dans la régulation des protéines Rho3 et Rho4 Effectuer les cribles pour rechercher les phosphatases de la protéine Rgd1

23 Merci de votre attention
Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2