Présenté par NGUYEN Khac Minh Huy Le 10 juin 2008.

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1 Présenté par NGUYEN Khac Minh Huy Le 10 juin 2008

2 Plan I/ Introduction II/ Matériel et méthode 1/ matériel 2/ méthode d’échange de contre ion 3/ préparation des échantillons 4/ techniques utilisées III/ Résultat et Discussion IV/ Conclusion

3 I/ INTRODUCTION Equipe de Maïté PATERNOSTRE: études des mécanismes et des interactions moléculaire non covalentes. Auto assemblage d’un octapeptide: lanréotide Lanréotide:

4 INTRODUCTION (suite) Lanréotide: analogue thérapeutique de somatostatine Utilisation dans le cadre de traitement de l’acromégalie Acormégalie: pathologie liée à la croissance anormale de l’hormone de croissance But de ce stage: caractérisation de l’influence de nature de contre ion sur l’assemblage

5 II/ Matériel et méthode 1/ matériel le lanréotide synthétisé par IPSEN Pharma l’eau dé ionisée pour la solution la forme acide des contre ions de Hofmeister: H 2 SO 4, CH 3 COOH, HCl, HNO 3 et HClO 4

6 II/ Matériel et méthode 2/ Méthode d’échange des contre ions  1 ère étape: 2 amines protonées à pH neutre pKa est autour de 10 à 11 Adition de NaOH à la solution pour que le pH soit supérieur à pKa

7 II/ Matériel et méthode (suite) 2/ Méthode d’échange des contre ions  1 ère étape (suite) Lanréotide: déprotoné, insoluble, précipite centrifuge et lavage pour enlever le surnageant  obtention de lanréotide pure à cette étape

8 II/ Matériel et méthode (suite) 2/ Méthode d’échange des contre ions  2 è étape: Suspension de précipité dans la solution d’acide du contre ion Milieu acide  reprotonement de lanréotide Fixation de contre ion pour compenser les charges  Obtention de lanréotide/contre ion

9 II/ Matériel et méthode (suite) 3/Préparation de l’échantillon Obtention de différents échantillons par la lyophilisation (environ 48h) Dilution de de lanréotide/contre ion avec différentes concentrations (5% et 10%) Mise en capillaire afin de faire la diffusion de rayon X

10 II/ Matériel et méthode (suite) 4/ Techniques utilisées  Diffusion de rayon X aux petites angles L’expérience est réalisée sur la ligne de lumière ID2 à ESRF (Grenoble)

11 II/ Matériel et méthode (suite)  Spectroscopie infrarouge de transformée à Fourier L’expérience se fait sur le spectrophotomètre de type Bruker IFS 66

12 III/ RESULTAT ET DISCUSSION 1/ Caractérisation de l’assemblage du lanréotide Spectroscopie vibrationnelle de lanréotide dans l’eau avec différente concentration

13 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Spectre d’absorption de l’acétate

14 %fréquence% aireattributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 1% 1642,984,73random6,777 1678,116,46 feuillet-β antiparallèle 1,231 2% 1640,7281,7random6,537 1677,718,29 feuillet-β antiparallèle 1,471 3% 16361849,92random3,994 1661,1836,25boucle2,93 1614,9911,37 feuillet-β antiparallèle1,581 1687,388,45 4% 1638,1347,67random3,994 1663,4228,51boucle2,22 1616,4714,2 feuillet-β antiparallèle1,92 1687,769,61 5% 1639,2646,17random3,694 1664,1626boucle2,082 1617,7218,92 feuillet-β antiparallèle2,222 1688,328,89 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition du spectre FTIR dans la gamme amide I du lanréotide/eau

15 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition du spectre FTIR dans la gamme amide I du lanréotide/eau %fréquence% aireattributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 6% 1637,543,65random3,494 1662,7130,52boucle2,442 1616,1417,27 feuillet-β antiparallèle2,062 1689,778,55 7% 1639,3938,52random2,843 1663,3625,25boucle2,022 1619,325,81 feuillet-β antiparallèle2,893 1689,3610,4 8% 1639,5638,67random2,843 1663,3623,61boucle2,022 1619,325,81 feuillet-β antiparallèle2,893 1689,3610,4 9% 1639,3737,75random3,13 1663,9521,63boucle1,732 1619,2529,15 feuillet-β antiparallèle3,23 1690,2311,45 10% 1639,2937,9random33 1663,2727,96boucle2,232 1619,4624,55 feuillet-β antiparallèle2,753 1689,559,88

16 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Résultat du spectroscopie infrarouge du lanréotide/eau La modification de spectre se fait à partir de 3%. Les liaisons hydrogène commencent à se former et se structurer afin de stabiliser l’assemblage. Pour les faible concentration (1% et 2%), les liaisons hydrogènes dans la conformation aléatoire sont majoritaires. Cela explique la solubilité de lanréotide dans l’eau à faible concentration. Ce sont des liaisons hydrogène avec la molécule d’eau.

17 III/ RESULTAT ET DISCUSSION 2/Caractérisation de l’assemblage des lanréotides/contre ions Spectre de 10% du lanréotide/H 2 SO 4

18 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition de spectre FTIR dans la gamme amide I du lanréotide/H 2 SO 4 (10%) fréquence%aireattributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 1641,129,14random2,332 1664,618,47Boucle1,471 ou 2 1620,143,8 feuillet β antiparallèle 4,14 1691,18,5

19 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition du spectre FTIR dans la gamme amide I des lanréotide/contre ions Lan/contre-ionfréquence%aireAttributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 5% lan/ac. Acétique 1637,556,1Random4,483 ou 4 1664,113,2Boucle1,051 161414 feuillet β antiparallèle2,372 ou 3 1683,715,8 10%Lan/ac.acétique 1640,329,19Random3,063 1664,620,17Boucle1,82 1619,942 feuillet β antiparallèle3,133 1690,98,5 5% Lan/H2SO4 1640,936,63Random2,933 1664,919,41Boucle1,552 ou 3 1618,535,5 feuillet β antiparallèle3,513 ou 4 1690,38,41 10%Lan/H2SO4 1641,129,14Random2,332 1664,618,47Boucle1,471 ou 2 1620,143,8 feuillet β antiparallèle4,14 1691,18,5 5%Lan/HNO3 1641,428,45Random2,272 1664,622,94Boucle1,832 1621,139,99 feuillet β antiparallèle3,884 1690,68,6 10%Lan/HNO3 1641,136,14Random2,893 1665,118,2Boucle1,451 ou 2 1618,536,3 feuillet β antiparallèle3,643 ou 4 1690,29,3

20 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Décomposition du spectre FTIR dans la gamme amide I des lanréotide/contre ions (suite) Lan/contre-ionfréquence%aireattributionN(C=O) calculéN(C=O) entier 5% lan/HCl 1640,732,22random2,572 ou 3 1664,325,07boucle22 1619,634,42 feuillet β antiparallèle3,443 ou 4 1690,28,28 10%Lan/HCl 1641,129,19random2,332 ou 3 1664,620,17boucle1,621 ou 2 1619,942 feuillet β antiparallèle4,044 1690,98,5 5%Lan/HClO4 1641,128,44random2,273 1664,424,65boucle1,972 1620,938,9 feuillet β antiparallèle3,743 1669,27,96 10%Lan/HClO4 1641,134,07random2,723 1664,520,58boucle1,641 ou 2 1620,437,23 feuillet β antiparallèle3,623 ou 4 1691,18,1

21 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Résultat de la spectroscopie infrarouge des lanréotide/contre ion La nature du contre ion ne provoque pas le changement de l’empilement moléculaire du peptide Le nombre de carbonyle dans les conformations impliquées ne change pas par rapport au lanréotide commercialisé

22 III/ RESULTAT ET DISCUSSION Résultat de la diffusion de RX des lanréotide/contre ion Différence de diamètre du tube en fonction du rayon ionique du contre ion Difficile à interpréter le résultat de contre ion SO 4 2- car il s’agit d’un contre ion divalent Contre-ionDiamètre du tube de lanréotide/contre-ion (nm) Cl - 20 NO 3 - 20,5 ClO 4 - 22,1 CH 3 COO - 24

23 IV/ CONCLUSION La nature de contre ion n’influence pas de l’empilement moléculaire du lanréotide. Les objets formés sont toujours nanotubes quelque soit la nature de contre ion. La nature des contre ions change le diamètre du tube. Pour l’avenir, les chercheurs continuent à échanger d’autres anions monovalents de rayon ionique différents pour valider ou invalider ces résultats.