Clonage Moléculaire.

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1 Clonage Moléculaire

2 Définitions Clonage : Sous-clonage: Plasmide recombinant:
Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale (Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN Sous-clonage: Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou d’une partie de celle-ci d’un vecteur à un autre vecteur Plasmide recombinant: Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit Organisme recombinant Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été introduit

3 Pourquoi cloner? Séparer, identifier, manipuler ou exprimer un fragment spécifique d’ADN 3

4 Étape 1- Séparer Deux approches: Fragmenter/digérer l’ADN génomique
Génère un très grand nombre de fragments Peut-être difficile de retrouver le fragment d’intérêt Amplification par PCR Beaucoup moins de fragments Beaucoup plus facile de retrouver la séquence d’intérêt

5 Cloner Enzyme de restriction Enzyme de restriction
Générer des extrémités compatibles Ligature d’ADN Vecteur approprié Fragment d’intérêt Ligature Intermoléculaire Recombinant Ligature Intramoléculaire Non-Recombinant Transformation Cellules Hôte Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante 1 plasmide/1 cellule

6 Amplification des Plasmides Recombinants
Duplication de plasmide 1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert Croissance bactérienne

7 Criblage et Identification de Clones Recombinants Plasmidiques
Cartographie de restriction Hybridation PCR

8 Expression Pourquoi? Produire la protéine dans un système hétérologue
Produire la protéine en grande quantité Purifier la protéine Étudier l’activité de la protéine

9 Amplification, Mutagenèse, Clonage & Expression de LacZ– Projet II
Partie I Amplification & mutagenèse par PCR du gène LacZ Partie II Clonage de LacZ dans pUC19 Partie III Essai enzymatique des protéines recombinantes

10 Purification & Digestion de l’ Amplicon LacZ
Purification par QiaQuick Permet de retirer le tampon, sels, etc. Permet de retirer les amorces Permet de retirer l’enzyme Digestion Sites de restriction PstI et NdeI ont été ajoutés à la séquence de l’amplicon Absent dans la séquence de LacZ Unique dans le vecteur pUC19 Permet le clonage dirigé