Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009

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1 Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009
Laboratoire & allergologie Nouvelles applications Parler de : BAT pour avoir confirmation d’un IgEs pos et Test cutané Neg ImmunoCAP ISAC peu de serum et bcp d’informations Allergènes recombinants : etude didier ebo Allergies alimentaires et leur evolution Nos tests au CHU noisette cacahuète Nutella Colloque de Pédiatrie Phn. Biol. E. Cavalier Phn Romy Gadisseur 11/12/2009

2 Epidémiologie de l’allergie
Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009 Epidémiologie de l’allergie 4ème maladie chronique (OMS). Asthme allergique = 1ère maladie chronique chez l’enfant . +/- 30% allergiques. Coût pour la société +++. Allergies x 2 ces 15 dernières années dans les pays développés !! La raison ? Train de vie occidentalisé. Meilleure hygiène de vie ↓ infections => Réponse immunitaire modifiée et dirigée vers les allergènes de l’environnement : Dévelopment d’allergies. ↑ utilisation d’antibiotiques. Modification du régime alimentaire. Vie sédentaire (hygrometrie ++ & température ++) & Exposition aux allergènes domestiques >> exposition à de nouveaux allergènes (confinement, air conditionné, animaux domestiques…). Tabagisme passif de l’enfant (favorise la synthèse d’IgE). Pollution atmosphérique +++. Nouveaux allergènes (latex) Risque plus important d’être allergique si: Enfant unique, Niveau social aisé, Pas été à la crèche, Prise d’antibiotiques durant la petite enfance, Vie citadine. les micro-particules polluantes pouvaient avoir un effet initiateur de l’allergie chez les enfants sains. En d’autres termes, la pollution contribuerait à rendre allergiques les enfants sains. Over the last few decades, the prevalence of allergic diseases has increased dramatically in developed nations. The resulting burden on healthcare systems worldwide has provoked a whole series of research initiatives among allergy experts and commercial companies that aim to develop novel tests to improve the diagnostic risk assessment and early preventive treatment of disease. The advent of protein microarray technology has fuelled aspirations of multianalyte immunological applications that permit the simultaneous analysis of huge numbers of disease-related parameters

3 Allergie : Définition…
“ Allergie ”   Maladie due à une réponse inadaptée et excessive de notre organisme vis à vis de l’environnement : des substances étrangères et normalement inoffensives entraînent une réaction de défense de notre système immunitaire, nuisible à l’organisme. Allos = différent Ergon = agir.

4 Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs (I)
Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009 Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs (I) Hypersensibilité de type 1 (H. immédiate, allergie réaginique ou atopique) : Immunité humorale = Allergie. Médiée par les IgE spécifiques d’un allergène (IgE dépendante). Tendance héréditaire. Manifestations cliniques diverses (dermatite allergique, rhinite pollinique). Apparaissent en quelques minutes. Les IgEs fixées sur les mastocytes tissulaires et sur les basophiles sanguins, réagissent avec l’Ag (allergène), induisant ainsi la dégranulation de ces cellules (libération d’histamine et d’autres médiateurs). 1975 Médiée par les IgE spécifiques d’un allergène Manifestations cliniques diverses eczema, anaphylaxie, asthme L'allergie est un phénomène qui s'amplifie au cours des stimulus, surtout en l'absence de traitement et/ou prévention, provoquant: - des manifestations cliniques de plus en plus sévères (aggravation des signes, pouvant aller jusqu'à un choc A en ce qui concerne l'HS1). - une augmentation progressive du nombre d'allergènes auquel l'individu réagit (poly-sensibilisation), surtout chez un individu atopique. Il est important de sensibiliser le propriétaire d'un animal à cet aspect, car plus la prise en charge est précoce, plus elle est efficace. Une caractéristique principale de l'HS est son caractère individuel: seuls certains individus développeront une HS (alors que la majorité des individus soumis au même problème ne développeront pas d'allergie ou de complication). 2 raisons peuvent l'expliquer: - les conditions d'apparition d'une HS lors de stimulations antigéniques répétées sont complexes et mal connues (dose antigénique, durée et nombre de contacts, facteurs favorisants???): un grand nombre de mécanismes immuns sont modifiés au cours de l'HS sans qu'il soit facile de faire la part des choses (production de nombreuses cytokines, activation de sous-types lymphocytaires..). Une prédisposition génétique à développer certains types de réponse immune a été observée en particulier dans le cas de l'HS1 (atopie).

5 Hypersensibilité type 1
Fixation des anticorps IgE sur la membrane du mastocyte (ou du basophile), Fixation des antigènes sur les anticorps cytophiles, Dégranulation du mastocyte (ou du basophile). NB : Pas d’intervention du complément. Manifestations cliniques : Choc anaphylactique, asthme, rhinite, conjonctivite, urticaire, troubles digestifs, (eczéma).

6 Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs
Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009 Hypersensibilités : Classification de Gell et Coombs Intolérances Une intolérance alimentaire est le termes destinés à désigner une anomalie de l’organisme dans sa capacité à digérer un composant alimentaire. C’est donc un terme général qui décrit une réponse physiologique anormale à l’ingestion d’une substance alimentaire. Contrairement à l’allergie, cette réaction ne fait pas intervenir un processus immunologique. Il s’agit souvent d’une anomalie acquise génétiquement. Les symptômes de l’intolérance sont souvent de type gastro-intestinaux, mais peuvent dans certains cas être d’origine cutanée,.... Cependant, la majorité des patients sont asymptomatiques.

7 Ligne du temps… diagnostic de l’allergie.
Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009 Ligne du temps… diagnostic de l’allergie. Standardisation des extraits allergéniques Panels d’allergènes recombinants mimant des extraits allergéniques Caractérisation & désignation des IgE ImmunoCAP ISAC (Phadia/ VBC Genomics) 1ers allergènes clonés Tests de Provocation (SPT) Premier ”allergen microarray” RAST 1880 1967 2000 2008 Simplified overview of the historical development of allergy diagnosis and treatment. Tests IN-VIVO Tests IN-VITRO Component – Resolved -Diagnostics

8 Recombinants : Production

9 Components - Resolved Diagnosis (CRD)
Component-Resolved Diagnosis uses defined recombinant allergens to dissect the individual patient’s IgE reactivity profile with the aim of identifying the disease-eliciting molecules. Valenta R et al, Clin Exp Allergy 1999 Molecules, genuine markers tell you the truth ! Mari A., VIP Customers day, Brussels, 17th November 2009. La présence d’IgE pour des composants allergéniques qui causent des réactions croisées peut être déterminée et utilisée pour prédire une sensibilisation pertinente cliniquement à des sources allergéniques qui contiennent des allergènes proches au niveau de la structure et au niveau de leur activité immunologique.

10 Allergènes, Bases de données
Allergènes de la cacahuète Propriété biochimique de l’allergène

11 IgE « spécifiques » pour un extrait
Du point de vue du laboratoire… Que veut dire un taux d’IgEs pour un extrait allergénique ? Que faire de ce résultat ? Qu’en est-il des soins pour le patient ? Qu’en est-il du risque pour le patient ? Impact sur le suivi du patient et sa santé (appréciation de la sévérité, risques, choix thérapeutiques, amélioration de la qualité de vie du patient). Y a-t-il un intérêt à réaliser du Component-resolved diagnosis en routine dans notre laboratoire? Comment peut-on réaliser du CRD dans notre labo? Notre expérience avec la sensibilisation à l’arachide… + IgEs pour f13, anamnèse, recombinants Question :”Doit-on recommander une éviction stricte de l’arachide ?”

12 Cas Clinique (I) 1. Julie, F (29 ans): f13 (arachide) = 27.4 kUA/L.
SPT + : arachide, noix, noisette, graine de sésame, graminées, bouleau, pignon. SPT - : soja, oeuf et noix. Asthme, troubles gastrointestinaux et érythème après ingestion de noix.

13 Cas Clinique (II) 2. Laurent, H (24 ans): Maud, F (15 ans):
f13 (arachide) = 1.22 kUA/L. IgEs + : bouleau, pomme, poire, pêche, abricot, noisette, noix et récemment céleri et fenouil. Atopie, polysensibilisé, oral allergy syndrome (OAS) et évolution récente vers des difficultés respiratoires. Maud, F (15 ans): f13 (arachide) = 1.23 kUA/L IgEs + : pollens de graminées, lait de vache, carotte, orange, tomate, froment, pomme de terre, oignon, ail, céleri, banane, pêche et arachide. Sensibilisation à différentes variétés de plantes Troubles gastro-intestinaux.

14 Cas Clinique (III) Eddy, M (43 ans) : f13 (arachide) = 0,44 kUA/L
SPT+ : bouleau, pomme, pêche, banane, ail, arachide. Gonflement des lèvres. Sensibilisation au bouleau… Que pouvons-nous conclure?

15 Cas Clinique (IV) 5. Nadia, F (24 ans) : f13 (arachide) = 1,73 kUA/L
f17 (noisette) = 4,23 kUA/L IgEs + : pomme, pêche, noisette, arachide SPT +++ : arachide, noix, noisette.. Atopie, polyallergie, rhinoconjonctivite, OAS, urticaire et angiœdème Pour ces 5 cas cliniques… Les taux d’IgEs pour l’extrait d’arachide sont-ils proportionnels à la sévérité de l’allergie ? Qu’en est-il du risque? Régime d’éviction ou non ? Quel suivi pour le patient? Evolution du patient ? ?

16 Prédire les réactions croisées
Proteines de stockage Présente dans les graines, ressource matérielle lors de la croissance de la plante. Parfois, stable et résistante à la chaleur causant des réactions aux aliments cuits. rSes i 3 rBer e 1 Cor a 9 Ara h 1 Ara h 2 Ara h 3 nGly mβ-conglycinin nGly m glycinin

17 Prédire les réactions croisées
Protéines PR-10, Bet v 1 homologue Instable à la chaleur, aliment cuit toléré en général. Breiteneder H, Biotechnol Adv, 2005 Associé à des symptômes locaux comme l’Oral Allergy Syndrome (OAS). Associé aux réactions allergiques aux fruits et légumes au Nord de l’Europe. Cor a Cor a 1.04 Gly m 4 Api g 1 Ara h 8 Dau c 1 Bet v 1 Pru p 1 Mal d 1 Pyr c 1 Pru ar 1 Pru av 1

18 Oral Allergy Syndrome (OAS)
Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009 Oral Allergy Syndrome (OAS) Syndrome d’Allergie Orale : Réaction allergique, gêne au niveau de la bouche qui apparaît instantanément ou peu de temps après l’ingestion de l’aliment. Un chatouillement ou sensation de brûlure au niveau des lèvres, de la bouche et/ou du pharynx. Associé à la sensibilisation à une ou plusieurs protéine de type PR-10 càd homologue de Bet v 1 (bouleau). Noisette, 46% Pomme, 39% Pêche, 24% Cerise, 22% Noix, 21% Poire, 20% Amande, 19% Prune, 17% Noix du Brésil, 16% Pomme de terre, 15% Carotte, 13% Arachide, 10% Fraise, 10% Orange, 9% Abricot, 7% PR-10 allergic reactions that occur rapidly, within minutes of eating a trigger food. The most common reaction is an itching or burning sensation in the lips, mouth, and/or pharynx. Allergies to a certain pollen are associated with OAS reactions to certain foods. For Alder pollen: almonds, apples, celery, cherries, hazel nuts, peaches, pears, parsley Birch pollen: almonds, apples, apricots, avocados, carrots, celery, cherries, chicory,[4] coriander, fennel, fig,[5] kiwifruit, nectarines, parsley, parsnips, peaches, pears, peppers, plums, potatoes, prunes, soy, wheat; Potential: hazel nuts, and walnuts Grass pollen: fig,[5] melons, tomatoes, oranges Mugwort pollen : carrots, celery, coriander, fennel, parsley, peppers, sunflower Ragweed pollen : banana, cantaloupe, cucumber, honey dew, watermelon, zucchini; Potential: Dandelions or chamomile tea Possible cross-reactions (to any of the above): berries (strawberries, blueberries, raspberries, etc), citrus (oranges, lemons, etc), grapes, mango, figs, peanut, pineapple, pomegranates, watermelon rBet v 1 rPru p 1 rGly m 4 rAra h 8 rApi g 1.01 rAln g 1 rCor a 1 nAct d 8 rMal d 1 rDau c 1

19 Prédire les réactions croisées
LTP (non-specific Lipid Transfer Protein, nsLTP) Protéines stables à la chaleur et à la digestion, causent donc aussi des allergies aux aliments cuits. Souvent associées à des réactions systémiques, réactions plus sévères qui suivent l’OAS. Les LTPs causent souvent des allergies alimentaires aux fruits en l’absence d’allergie pollinique. Souvent, associées aux réactions allergiques aux fruits et légumes au Sud de l’Europe. LTP Zea m 14 nPru p 3 rCor a 8 rPar j 2 nArt v 3 Ara h 9 Mal d 3 Zea m 4 Jug r 3 Cor a 8 Pru p 3 Pru av 3 Mal d 3 Pru ar 3 Ara h 9

20 Prédire les réactions croisées
Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009 Prédire les réactions croisées Profiline Rarement associée à des symptômes cliniques mais réactions sévères pour une minorité de cas. Les profilines sont présentes dans une large variété de pollens (d’arbres, d’herbacées et de graminées) et d’aliments d’origine végétales. Il y a une grande homologie de structure entre les profilines des différents fruits et légumes. Ara h 5 PFL rBet v 2 rPhl p 12 rMer a 1 rPhl p 12 rBet v 2 nOle e 2 rMer a 1 rHev b 8 rMal d 4 rPru p 4 nAct d 9 nAna c 1 nAra h 5 profilin in cross-reactivity between Latex profilin and other plant profilins. rPhl p 12 rBet v 2 nOle e 2 rMer a 1 rMal d 4 rPru p 4 nAct d 9 nAna c 1 Fra a 4 nAra h 5 Cor a 2 rApi g 4 rDau c 2 rHev b 8 rMal d 4 Pru p 4 rOle e 2 rCor a 2 rPyr c 4

21 Symptômes caractéristiques Profil de sensibilisation
En résumé… Symptômes caractéristiques Profil de sensibilisation protéines PR-10 ns-LTP Local (OAS) Systémique Profilines

22 Réactions croisées in-vitro
CCD (MUXF3) : Marqueur de sensibilisation aux déterminants carbohydrates (cross-reacting carbohydrate determinants). Glyco-épitopes. Présents dans la majorité des plantes, Il s’agit d’IgEs dirigés contre les glycans : causent des profils de sensibilisations croisées larges parmi les extraits allergéniques (parfois responsables de réactions croisées in-vitro). effets « in-vivo » ? Rarement associé à des symptômes cliniques… Mais, publications ? A confronter aux informations cliniques et aux SPT… Tester si… Sensibilisation aux fruits et légumes, graînes. Sensibilisation au latex chez un patient pollinique sans exposition occupationnelle. Sensibilisation au venin d’Hyménoptère avec/sans sensibilisation aux pollens.

23 Arachis Hypogea Allergenicity :
Ara h 9 : nsLTP Stable à la chaleur et à la digestion. Réactions sévères >> réactions systémiques ! Ara h 8 : Profiline Réactions croisées entre de nombreux fruits et légumes. CCD (MUXF3) Cross-reactive Carbohydrate Determinants Rarement associés à des symptômes. Présent dans la majorité des plantes. Ara h 1 : Protéine de stockage (vicilline) allergène majeur Ara h 2 : Protéine de stockage (conglutine) + fréquent, sensitizing potential ++, stability ++ to digestion. Ara h 3 : Protéines de stockage (glycinine) allergène mineur, rares sensibilisations. Ara h 8 : PR-10 allergènes majeurs de l’arachidechez les patients allergiques au pollen de bouleau. Sensible à la chaleur et à la digestion. Allergenicity : Ara h 2 est un allergène 100 fois plus puissant que Ara h 1 Koppelman SJ et al, Clin Exp Allergy 2004,34:583 Ara h 2 possède un haute stabilité protéolytique Lehmann K et al, Biochem J, 2006: Après rôtissage de l’arachide, l’allergénicité d’Ara h 2 est multipliée par 3 Maleki SJ et al, J Allergy Clin Immunol, 2003

24 Du point de vue du laboratoire : Comment contribuer à diagnostiquer une allergie à l’arachide ?
Arachide (f13) + Ara h 2 (f423) Arachide (f13) : Nég Ara h 2 : Nég Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Nég Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Pos Peu de risque de réactions sévères Risques de réaction sévère? Très haut risque de réaction sévère Comment explorer? Recommendations Comment explorer ? Recommendations Test : Risque Ara h 1 (f422) Ara h 3 (f424) Ara h 9 (f427) Ara h 8 (f352) CCD (Ro214) Bouleau (Nord de l’Europe) : test Ara h 8 (f352)

25 Cas clinique (1) 1. Julie, F (29 ans): f13 (peanut) = 27.4 kUA/L.
SPT + : arachide, noix, noisette, graîne de sésame, bouleau, graminées, pignon de pin. SPT - : soja, blanc d’oeuf, noix. Asthme, intolérance gastrointestinale et érythème après ingestion de noix. Quels sont les risques ? Bouleau?

26 Très haut risque de réaction sévère Comment explorer? Recommendations
Cas clinique (1) Arachide (f13) = 27,4 kUA/L Ara h 2 (f423) = 14,2 kUA/L Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Pos Très haut risque de réaction sévère Sensibilisation à Ara h 8 due à une allergie au bouleau (PR-10). Sensibilisation à 3 allergènes majeurs d’arachide. Sensibilisation à Ara h 2 : Protéine de stockage (conglutine), Stable ++ à la digestion, régime d’éviction d’arachide car risque de réaction sévère ++. Comment explorer? Recommendations Réactions croisées : protéines de stockage ?? Tests : Risques Ara h 1 = 3,46 kUA/L Ara h 3 = 0,6 UA/L Ara h 9 <0,1 kUA/L Ara h 8 = 2,27 kUA/L CCD < 0,1 kUA/L Allergènes majeurs de l’arachide Protéines de stockage protéine PR-10 de l’arachide !

27 Cas clinique (2) 2. Laurent, H (24 ans) : f13 (arachide) = 1.22 kUA/L.
IgEs + : bouleau, pomme, poire, noix, noisette, abricot, et récemment céleri et fenouil. Atopie, polysensibilisé, oral allergy syndrome(OAS) et récemment évolution vers des difficultés respiratoires. Quels sont les risques? Qu’en est-il de la sensibilisation au Bouleau ? Et l ’évolution récente de l’allergie ?

28 Risques de réaction sévère ? Comment explorer ? Recommendations
Cas clinique (2) Arachide (f13) = 1,22 kUA/L Ara h 2 (f423) < 0,10 kUA/L Sensibilisation à l’arachide après allergie au bouleau (PR-10 proteins). Sensibilisation aux autres PR-10 : - Pomme (Mal d 1), poire (Pyr c1), pêche (Pru p 1), abricot (Pru ar 1), noisette (Cor a 1) et récemment le céleri (Api g 1) Dans ce cas, évolution de l’OAS avec détresse respiratoire expliquée par une une sensibilisation récente à Api g 1. Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Nég Risques de réaction sévère ? Comment explorer ? Recommendations Tests : Risque Ara h 1 < 0,1 kUA/L Ara h 3 < 0,1 kUA/L Ara h 9 < 0,1 kUA/L Ara h 8 = 8,4 kUA/L CCD < 0,1 kUA/L PR-10, Bet v 1-homologue

29 Cas clinique (3) Maud, F (15 ans): f13 (arachide) = 1.23 kUA/L
IgEs + : pollens de graminées, lait de vache, carotte, orange, tomate, froment, pomme de terre, ail, oignon, céleri, banane, pêche et arachide. Sensibilisation à une large variété d’aliments issus du règne végétal. Troubles gastro-intestinaux. Quels sont les risques ? Sensibilisations multiples aux fruits et légumes.

30 Risques de réaction sévère? Comment explorer ? Recommendations
Cas cliniques (3) Arachide (f13) = 1,23 kUA/L Ara h 2 (f423) < 0,1 kUA/L Sensibilisation aux CCD : - Marqueurs de sensibilisation aux Déterminants Carbohydrates. - Multiple réactions croisées. - Rarement associé à des symptômes cliniques. Tester les CCD si sensibilisations aux fruits et légumes, graînes. Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Nég Risques de réaction sévère? Comment explorer ? Recommendations Tests : Risques Ara h 1 < 0,1 kUA/L Ara h 3 < 0,1 kUA/L Ara h 9 < 0,1 kUA/L Ara h 8 < 0,1 kUA/L CCD = 1,93 kUA/L CCD

31 Cas clinique (4) 4. Eddy, M (43 ans) : f13 (arachide) = 0,44 kUA/L
SPT+ : bouleau, pomme, pêche, banane, ail et arachide. Gonflement des lèvres Quels sont les risques ? Sensibilisation au bouleau…

32 Risque de réaction sévère? Comment explorer ? Recommendations
Cas clinique (4) Arachide (f13) = 0,44 kUA/L Ara h 2 (f423) < 0,1 kUA/L Sensibilisation aux profilines (Bet v 2) Rarement associées à des symptômes cliniques sauf des OAS. De très rares réactions sévères dans une minorité de patients. Présence de profilines dans de nombreux fruits et légumes. - Bouleau (Bet v 2), pomme (Mal d 4), pêche (Pru p 4), banane (Mus a 1), ail (All c 4), arachide (Ara h 5). Arachide(f13) : Pos Ara h 2 : Nég ? Risque de réaction sévère? Comment explorer ? Recommendations Bet v 2 = 4,6 kUA/L Testés Ara h 1 < 0,1 kUA/L Ara h 3 < 0,1 kUA/L Ara h 9 < 0,1 kUA/L Ara h 8 < 0,1 kUA/L CCD < 0,1 kUA/L

33 Cas clinique (5) 5. Nadia, F (24 ans): f13 (arachide) = 1,73 kUA/L
f17 (noisette) = 4,23 kUA/L IgEs + : pomme, pêche, noisette et arachide SPT +++ : arachide, noix et noisette. Atopie, polyallergie, rhinoconjonctivite, OAS, urticaire et angiœdème Quels sont les risques ? …angioedème…

34 Cas clinique (5) Arachide (f13) = 1,23 kUA/L
Ara h 2 (f423) <0,1 kUA/L Noisette (f17) = 4,23 kUA/L Cor a 8 (f425) = 3,87 kUA/L Arachide (f13) : Pos Ara h 2 : Nég Noisette (f17) : Pos Cor a 8 : Pos nsLTP Risque de réaction sévère? Très haut risque de réaction sévère Comment explorer? Recommendations Sensibilisation aux nsLTP : Marqueur de réaction croisée. Associé à des réactions sévères. Principalement dans le sud de l’Europe. Sensibilisation à la pomme (Mal d 3), pêche (Pru p 3), noisette (Cor a 8) et arachide (Ara h 9). Test : Risques Ara h <0,1kUA/L Ara h 3 <0,1kUA/L Ara h 9 = 8,2 kUA/L Ara h 8 <0,1kUA/L CCD <0,1kUA/L nsLTP

35 Si nous suivons la même démarche, grâce à tous les recombinants,
Plus complexe… Julien, B (18 ans): Cas clinique complexe !! Atopie, Dermatite atopique, Rhinite perannuelle, Eczema géant. Allergie alimentaire (blanc d’oeuf, arachide, soja, crabe et ail) Comment expliquer les symptômes ? SPT Pneumallergènes: + : D1 et D2, chien, graminées. Douteux : bouleau. SPT Trophallergènes : + Blanc d’oeuf, arachide, soja, ail. IgEs pour extraits Si nous suivons la même démarche, grâce à tous les recombinants, on pourrait tout expliquer !! Arachide,f13 9.71 Soja,f14 4.43 Crabe,f23 1.98 Ail,f47 4.11 Blanc d’oeuf,f75 0.61 Pityrosporum orbiculare,m70 3.93 Dermatophagoïdes pteronyssinus,d1 >10 Blanc d’oeuf,f1 5.37 Crevette ,f24 2.64 Gx3:g1+g5+g6+g12+g13 93.6 Bouleau,t3 58.0

36 En théorie, c’est possible…
Request form ImmunoCAP™Components Patient: Nom : B. Julien Adresse: Rue des bouleaux 1… Some other components less useful in Belgium could be available. Don’t hesitate to ask to your Lab in case of specific clinical history. June 2009 En théorie, c’est possible… En pratique, … Docteur: Nom: Cavalier Etienne Adresse : CHU de Liège Date de demande: 19/11/2009 Signature:

37 ImmunoCAP© ISAC Fruit de l’association des firmes Phadia (expert des tests diagnostic in-vitro) et VBC Génomics (expert en microarrays) : L’« ImmunoCAP ISAC ». Alliance de la recherche dans le domaine de l’allergologie moléculaire et de l’innovante technologie des biochips. Harwanegg C et al, Expert Rev Mol Diagn 2004 Multiplex moderne utilisé comme outil supplémentaire pour le diagnostic in-vitro, par les allergologue et spécialistes, basé exclusivement sur les composants allergéniques. Plateforme miniaturisée d’immunoessais pour la mesure des IgEs dirigés contre >40 sources allergéniques communes, en un seul dosage. Biopuce composée de 103 allergènes natifs et recombinants immobilisés sur une support solide. Allergènes choisis en fonction de leur pertinence dans l’établissement d’un profil de sensibilisation. Tests sur 20 μL de sérum ou sang total. Permet de réaliser du CRD rapidement et à moindre coût.

38 Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009
Triplet d’allergènes après réaction fluorescente Immuno Solid-phase AllergenChip (ISAC) Molécule allergénique Anticorps secondaire anti IgE humain couplé à une molécule de fluorescence Anticorps IgE (dans le sérum du patient) The allergen biochip is a solid substrate built from a glass plate that is chemically altered to retain allergenic protein molecules in a biologically active form. Picolitre quantities of each allergen preparation are deposited on spatially separate locations on the biochip. The resulting addressable microarray allows for many biological affinity reactions to be monitored in parallel (=multiplexing). In a single analytical step, the comprehensive allergen sensitisation profile of a patient can be measured using only a minute amount of serum or plasma; this is followed by automatic readout and report generation. The present chip used for in vitro diagnostics incorporates 103 allergens from about 50 different allergen sources. 4 sites de réaction

39 ImmunoCAP® ISAC : Version 103.
Protéines, Réactions croisées : 11 PR-10 : (protéines Bet v 1-like) : Bien representée, interêt ++ 4 nsLTP : En rajouter ? Lesquelles? 5 Profilines : Tant de profilines existent… Lesquelles sont les plus représentatives des différentes familles botaniques ? 5 Protéines de stockage ImmunoCAP ISAC version 103 sera remplacé en juin 2010 par version 125 (> 20 allergènes différents ajoutés) 2 Parvalbumines : Important ! Lesquelles sont les plus représentatives? 4 Tropomyosines : 5 albumines sériques : Venin de guêpe et d’abeille : Manque…

40 Immuno Solid-phase Allergen Chip (ISAC)

41 Validation de la méthode
Sélection de 19 sera de patients (6 hommes/13 femmes) IgEs + (> 0.10 kUI/L) pour des allergènes recombinants (ImmunoCAP ®250, Phadia). IgEs positifs et négatifs pour différentes sources allergéniques (latex, arachide, bouleau, fléole, noisette, pêche, soja, chien, chat…). En tout, nous avons comparé les résultats de 157 IgEs mesurés en CAP (allergènes recombinants) avec l’ISAC®. Nous avons testé 2 échantillons avec un haut taux d’ IgETot (> kU/L) en ISAC ®. Latex (rHev b 1; n=3, rHev b 3; n=3, rHev b 8; n=5), cross-reactive carbohydrate determinants (nAna c 2; n=2), soja (rGly m 4; n=4), arachide (rAra h 1; n=7, rAra h 2; n=7, rAra h3; n=5, rAra h 8; n=12), noisette (rCor a 8; n=3), noix du Brésil (rBer e 1; n=1), pêche (rPru p 1; n=11, rPru p 3; n=3), bouleau (rBet v 1; n=17, rBet v 2; n=11, rBet v 4; n=8), fléole (rPhl p 1; n=12, rPhl p2; n=2, rPhl p4; n=5; rPhl p 5; n=7, rPhl p 6; n=3, rPhl p11; n=1, rPhl p 12; n=5), Aspergillus fumigatus (rAsp f 6; n=2), Alternaria (rAlt a 1; n=3), chat(rFel d 1; n=7) ou chien (rCan f 1; n=4, rCan f 2; n=2, rCan f 3; n=2).

42 Validation de la méthode
Results: 17 résultats sur les 122 mesures d’IgEs positifs en CAP® furent trouvées négatives avec ISAC ® (concordance de 86%). 2 résultats sur les 35 mesures d’IgEs négatives en CAP® furent trouvées positives avec ISAC ® (concordance de 94%). Jusqu’à un taux d’IgETot égal à kU/L, nous n’avons pas observé de fixation non spécifique des anticorps.

43 Validation de la méthode
Discussion Concordance des résultats positifs de 86%. Peut-on expliquer les discordances? Cut-off d ISAC ® supérieur (>0,30 USI) au cut-off du CAP® (>0,10 kUA/L) De nombreuses mesures en ISAC ® étaient comprises dans le range de 0,10 et 0,30 USI. Concordance des résultats négatifs de 94%. 2 discordances concernaient des sera pour lesquels ISAC® a trouvé un résultat positif pour Ara h1 ou Ara h 3 (2 allergènes majeurs de l’arachide). Importance clinique de ces 2 allergènes ! Retour en arrière sur l’anamnèse clinique : Le premier patient avait des IgEs + en CAP pour Ara h 1 et Ara h 2, son test de provocation orale (TPO) à l’arachide était positif. - Anamnèse bien corrélée avec un vrai positif à Ara h 3 en ISAC ® Le 2nd patient avait subit un TPO pour l’arachide DOUTEUX, IgEs Ara h 8 ++, LTP ++, CCD +, patient polysensibilisé et régime d’éviction large (noisette, arachide, fruits de mer…) - Anamnèse bien corrélée avec un possible vrai positif en Ara h 1 en ISAC ®

44 B. Julien (18 ans) Bet v 1 homologues (PR-10):
Bet v 1, Aln g 1, Cor a 1, Mal d 1, Pru p 1, Gly m 4, Ara h 8, Api g 1 Marqueurs d’espèce : Gal d 1, Bos d lactoferrine, Fel d 1, Fel d 4, Can f 1, Mus m 1, Alt a 1 Profilines : Bet v 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 1, Phl p 12 Der p 1, Der f 1, Der f 2, Der p 2, Eur m 2 Pollens : Cyn d 1, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6 et Ole e 1 Grâce au CRD, nous trouvons des explications : Nombreuses allergies alimentaires dues à la sensibilisation aux profilines, protéines PR-10 (OAS), tropomyosine (fruit de mer), lait de vache… Nombreuses graminées, acariens, animaux domestiques… qui expliquent la rhinite perannuelle exacerbée durant le période pollinique. Tropomyosine : Der p 10

45 Autres nouveaux tests en allergologie
Les principaux allergènes impliqués dans l’allergie immédiate sont l’arachide, le poisson, les venins de guêpe et d’abeille, le latex et les médicaments. Le diagnostic est en général basé sur une histoire clinique évocatrice (incluant une association temporelle entre l’exposition à l’allergène et l’apparition des symptômes), des prick tests positifs (Gold Standard dans ce contexte) et, si disponible, le dosage d’IgEs. Lorsque le diagnostic in-vitro est indisponible via les moyens usuels (dosage d’IgEs) : Dans le cas des médicaments (AB, AINS, curarisants, …), additifs alimentaires, colorants, conservateurs, excipients. Dans le cas de discordances entre anamnèse clinique et résultats biologiques. Lorsque les résultats des tests in-vivo sont ininterprétables, ou irréalisables : Enfants Si risque ++ En cas de refus du patient de prendre un risque… Pensez aux tests de provocations in-vitro : CAST (Cellular Antigen Stimulation Test) BAT (Basophil Activation Test)

46 Nouveaux tests en allergologie
Ces tests offrent une nouvelle approche scientifiquement séduisante des réactions allergiques et d'intolérance en explorant leur mécanisme physiopathologique au niveau cellulaire. Le concept de ces tests est de mimer in-vitro le contact entre l’allergène et les cellules qui vont générer les symptômes. Sans danger pour le patient, ces tests de provocation in-vitro permettent d'explorer les réactions allergiques IgE-dépendantes. Il permettent non seulement d'objectiver mais aussi de quantifier la réactivité des leucocytes par : dosage quantitatif des sulfidoleucotriènes qu'ils sécrètent en réponse à une stimulation antigènique (CAST). Évaluation du pourcentage des basophiles activés via l’expression du marqueur CD63 de la membrane des basophiles activés (BAT). Techniques robustes et sur lesquelles on peut compter pour le diagnostic in-vitro des allergies immédiates et ce, en complément d’autres tests in-vitro déjà existants. Intérêt dans la clinique en routine. Mais : Nécessité d’une standardisation (seuil de décision clinique, dilutions des allergènes) Chaque allergène doit être étudié et testé un par un afin de déterminer la concentration optimale

47 A. Cellular Antigen Stimulation Test - CAST -
Test de provocation in-vitro. S’effectue sur du sang frais (cellules vivantes). Test ELISA (immunoessai) Il permettent d'objectiver et de quantifier la réactivité des leucocytes par dosage quantitatif des sulfidoleucotriènes qu'ils sécrètent en réponse à une stimulation antigénique. Les leucotriènes (LT) sont des médiateurs puissants de la réaction allergique et participent à la genèse des manifestations cliniques de type asthme, rhinoconjonctivite, urticaire, oedème angiomateux et choc anaphylactique. Grand intérêt dans le cadre des allergies médicamenteuses (AINS, Aspirine…), ou aux colorants, excipients… et pour les allergies aux venins.

48 B. Basophil Activation Test - BAT -
La cytométrie de flux est un outil intéressant pour l’analyse des différents types de cellules et permet d’identifier des populations cellulaires spécifiques, même dans le cas des populations présentes en petit nombre. La technique semble idéale pour étudier la dégranulation des basophiles induite par l’allergène. L’identification des cellules est basée initialement sur l’expression du CD45 (antigène présent à la surface de leucocytes) et sur la présence d’IgE à la surface cellulaire. Les basophiles expriment le récepteur de haute affinité pour les IgE (FcεRI). Dans cette population définie, l’activation des cellules après avoir été mises en contact avec l’allergène est déterminée par l’expression du marqueur CD63 de la membrane. CD63 est ancré dans la membrane des granules du basophile (contenant l’histamine) et son expression sur la partie externe de la cellule reflète la dégranulation cellulaire et la fusion des granules et la membrane plasmatique. L’expression du CD63 a été proposé comme un excellent moyen de monitorer l’activation des basophiles.

49 Basophil Activation Test - BAT -
Boumiza R , Clinical and Molecular Allergy 2005, 3:9

50 Basophil Activation Test - BAT -
Diagnostic : Allergies alimentaires Latex Venins Médicaments Curarisants, antibiotiques, AINS Sensibilité comparable aux IgEs. S’effectue sur du sang frais (cellules vivantes). Permet de comparer des extraits allergéniques et des allergènes recombinants (Immunothérapie spécifique). Suivre l’efficacité de l’Immunothérapie spécifique. Cette technologie a plus de potentiel que d’embûches et les résultats fournis par cette technique sont utiles dans plusieurs situations malgré le fait que chaque laboratoire ait son propre protocole. D. Ebo, Clinical & Experimental Allergy, 39 : 1115–1116 María L. Sanz et al,Drug Hypersensitivity. Basel, Karger, 2007, pp 391–402

51 En résumé La route de la découverte des profils de sensibilisation est tracée… Les extraits allergéniques sont utiles : En première intention, Ne permet pas de conclure dans tous les cas (multiple positivités des tests, manque de précision), IgEs pour les extraits pas toujours significatifs. Échecs de désensibilisation Ne permettent pas d’évaluer la sévérité des réactions allergiques Contribuent parfois à des régimes d’éviction trop larges… Le CRD est entre nos mains. Sensibilisations peuvent causer des erreurs de diagnostic (et erreurs thérapeutiques également). Familles de protéines décrites, similarités de structure (homologie de chaînes d’acides-aminés ou homologie de structure) Allergie à une seule protéine peut causer des réactions croisées à d’autres protéines de la même famille. Allergènes recombinants permettent de se focaliser sur un (ou plusieurs) allergène(s) d’une source : Disponibilité en CAP (et/ou en ISAC) ou en cours de développement…

52 En résumé Les microarrays peuvent nous être profitables, dans des cas difficiles : 103 recombinants or allergènes naturels purifiés en une seule détermination… Validation analytique de l’ImmunoCAP© ISAC : Concordance : 86% (résultats négatifs) et 94% (résultats positifs) L’ImmunoCAP© ISAC a un rôle à jouer dans le diagnostic et le soin aux patients avec des profils de sensibilisation complexes. Comme cette technique génère potentiellement des résultats inattendus, la réalisation et l’interprétation d’un microarray doivent être évalués en parallèle avec la clinique du patient. Interprétation des résultats difficile : Destiné aux spécialistes ! Nous sommes là pour vous aider…

53 En résumé L’ImmunoCAP ISAC est un outil de choix pour évaluer le profil de sensibilisation d’un patient : Polysensibilisé, atopique Dont l’anamnèse n’est pas très claire Dont les prick tests donnent beaucoup de positivités. L’ImmunoCAP ISAC permet de travailler sur une quantité MINIME de sérum (20µL) et de gagner du temps (et finalement de l’argent). La technique permet d’éviter les régimes d’éviction trop larges et d’améliorer le confort de vie du patient allergique/atopique… Intérêt en pédiatrie…

54 En résumé Les tests de BAT et de CAST ne sont pas à utiliser en première intention. Ils sont complémentaires aux tests cutanés et IgEs. Intérêt particulier quand ces tests ne peuvent être réalisés ou aboutissent à des résultats douteux en comparaison avec l’anamnèse clinique.

55 Cavalier - Gadisseur - 11/12/2009
Merci pour votre attention !!