Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique:  optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie.

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1 Anticorps monoclonaux à usage thérapeutique:  optimisation, nouveaux formats et défis technico-économiques Jean-Luc Teillaud (Equipe 14 « Biotechnologie des Anticorps », Centre de Recherche des Cordeliers/INSERM U.872)

2 Les anticorps monoclonaux: 37 ans d’Histoire
Publication de la technique d’obtention des anticorps monoclonaux (AcM): Köhler & Milstein, Nature, 256: 495, 1975 Premier AcM mis sur le marché (1986) : Muromonab (anti-CD3, souris) Derniers AcM mis sur le marché (2011) : ipilimumab (anti-CTLA-4), belimumab (anti-BLyS/BAFF) * 27 AcM ont actuellement une AMM [ USA (FDA) et Europe (EMA)]

3 Génération d’un AcM recombinant huIgG, 
ADNc VL VH ARNt/ARNm Lymphocyte B Hybridome AcM, HuIgG, Vecteur(s) avec séquences huC et huC Transfection Clonage Lignée cellulaire (CHO, NS1…)

4 Dualité fonctionnelle des anticorps (IgG1)
CH1 VH CL VL CH2 CH3 Fixation aux FcR Fab Fc Fixation à l’Ag Fixation au FcRn Les IgG sont des molécules constituées de 4 chaînes liées de façon covalentes. Les deux chaînes lourdes sont constituées d’un domaine variable VH et de trois domaines constants, CH1 à CH3, le domaine CH1 étant lié au domaine CH2 une région charnière. Les deux chaînes légères sont constituées chacune d’un domaine constant CL et d’un domaine variable VL. CLICK Cette molécule peut être séparée en trois fragments par digestion enzymatique utilisant la papaïne, deux fragments Fab, contenant la région variable responsable de la fixation d’un antigène spécifique, CLICK et un fragment Fc, support des fonctions effectrices de la molécule. CLICK Une IgG est capable de fixer le RFc néonatal, propriété permettant un allongement de sa 1/2 vie sérique. CLICK Ainsi qu’aux récepteur Fc des IgG ou RFcg par la partie C-terminale de la région charnière. Les AcM utilisées actuellement en oncologie sont majoritairement de IgG1 a cause de leurs propriétés effectrices qui semblent fortement liées à leur efficacité thérapeutique. D’une part, la lyse des cellules cibles par recrutement de molécules du complément. D’autre part, les recrutement de cellules immunitaires effectrices via les RFcg, permettant d’induire une cytotox dependante d’Ac ou ADCC, ainsi que de la phagocytose. Note: Tous des IgG1 sauf le Vectibix (panitumumab), humain = IgG2 = a-EGFR = cancer du colon, rectum

5 Modes d’action des AcM à usage thérapeutique
Neutralisation de l’interaction ligand soluble-récepteur (Ac anti-ligand, anticorps anti-récepteur): TNFa, IL1b, VEGF, IL6-R, EGF-R, CD25 (IL2-Ra), FceRI, toxine (charbon), C5 Blocage de l’activation d’un récepteur (HER2/Neu, EGF-R) Blocage de l’interaction cellule-cellule (CD11a, intégrine a4) Induction d’apoptose (CD20) Ciblage d’une drogue (CD33-ozogamicine*) * Retiré du marché

6 Modes d’action des AcM à usage thérapeutique
Activation de mécanismes effecteurs via la région Fc (ADCC, CDC, phagocytose, production de cytokines ou/et de chimiokines) (CD20, CD52) Induction d’une immunomodulation par blocage de molécules membranaires impliquées dans la co-stimulation ou son contrôle (CD4, CTLA-4) Induction d’une réponse immune adaptative cellulaire à long-terme

7 «L’anticorps murin qui voulait être humain»
L’infusion d’AcM de souris chez l’Homme => anticorps humains anti-Ac de souris (HAMA) => neutralisation et clairance accélérée de l’AcM => chute de l’efficacité, effets secondaires dus à la formation de complexes immuns et à leur dépôt. Les AcM de souris ne stimulent pas les fonctions effectrices de l’immunité de façon optimale chez l’Homme : => faible activation du complément, => mauvais recrutement des récepteurs pour la région Fc des Ig (RFc) et du RFcn (=> diminution de la T1/2).

8 Ingénierie cellulaire pour générer des AcM humains
1977 : Transformation par l’EBV de lymphocytes B pour produire des AcM (Steinmitz et al., Nature, 269: 420, 1977) Ac1 Ac2 Ac3 Clonage des cellules AcM Lignées B (EBV) Criblage Lymphocytes B du sang périphérique Transformation Donneur Immunisé EBV

9 Ingénierie moléculaire pour générer
des anticorps humains 1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

10 De la souris à l’Homme… AcM de souris AcM chimérique
Domaine Ig de souris Domaine IgG humaine

11 Ingénierie moléculaire pour générer
des anticorps humains 1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

12 AcM de souris AcM humanisé
De la souris à l’Homme… Domaine Ig murin Domaine Ig humain CDRs murin AcM de souris AcM humanisé

13 Génération d’un AcM recombinant humanisé huIgG1, 
Transfection AcM, HuIgG1, Clonage VL VH ARNt/ARNm Hybridome B de souris huVL huVH Séquençage Comparaison V humains Modélisation 3-D/cristal Détermination CDR/FR contact Greffe CDR Mutations ponctuelles FR Lignée cellulaire (CHO, NS1…) Vecteur avec séquences huC1 et huC

14 Humanisation d’un AcM recombinant
Substitutions d’a.a. des FR humains impliqués dans des contacts avec des a.a. des moCDRs greffés: remplacement des a.a. «humains» par les a.a. trouvés à la même position sur les VH/VL murins de l’Ac de souris («FR back mutations»)

15 Ingénierie moléculaire: anticorps humains
1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

16 Expression bactérienne de fragments d’anticorps: les « single chain Fv  (scFv) »
Espaceur VHa VLa L rbs Stop Etiquette (GGGGS)3 P scFv VH VL Fv

17 Ingénierie moléculaire: anticorps humains
1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

18 Banques combinatoires de phages
Phage filamenteux pIII scFv

19 Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display ») 1. Clonage et expression de régions Fab ou de scFv humains => production d’une banque de phages 2. Sélection de Fab ou de scFv spécifiques exprimés à la surface des phages 3. Isolement des VH/VL spécifiques et «reformatage» sous forme d’IgG entière 4. Transfection et production de l’AcM recombinant dans des cellules eucaryotes (CHO, NS1…)

20 Banques combinatoires de phages
Lymphocytes B humains ARNt/ARNm VL VH ADNc

21 Génération d’AcM humains: sélection de VH/VL humains par criblage de banques de phages filamenteux (« Phage display ») 1. Adsorption 2. Lavage 3. Elution (pH acide)

22 Génération d’un AcM recombinant humain
IgG1, à partir d’un phage sélectionné Phage sélectionné AcM, HuIgG1, huVL huVH PCR Vecteur avec séquences huC1 et huC Transfection Clonage Lignée cellulaire (CHO, NS1…) ADNc

23 Phage display: génération de fragments d’Ac mutés
scFv ou Fab 1. Phage parental * * 3. Banque de Phages mutants Purification de l’ADN wt ** * 2. Mutagenèse

24 Phage display: sélection de fragments d’Ac de forte affinité
2. Lavage Adsorption sur l’Ag (faible densité) * Banque de phages mutés 3. Elution Phage muté sélectionné (forte affinité)

25 Ingénierie moléculaire: anticorps humains
1984 : AcM chimériques souris/homme (Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6851, 1984) 1988 : Expression de fragments d’anticorps (fragment Fv simple chaîn, e Fv) dans E. coli (Skerra & Plückthun, Science, 240: 1038 ; Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879, 1988 ; Bird et al., Science, 242: 423, 1988) 1989 : AcM humanisés (Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029, 1989) 1989 : Banques combinatoires de phages exprimant des fragments d’Ac humains (Fab’, scFv) («Phage display») (Huse et al., Science, 246, 1275, 1989) 1994 : Production d’AcM humains par des souris transgéniques (Lonberg et al., Nature, 368: 856, 1994; Green et al., Nat Genet, 7: 13, 1994) ou trans-chromosomiques (Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97: 722, 1994)

26 Génération d’AcM humains: utilisation de souris transgéniques humanisées contenant les gènes d’Ac humains

27 Invalidation des gènes DJ & J (chaînes H & L) de souris (lignée A) 2. Insertion des gènes codant une partie des chaînes lourdes et légères humaines (YAC) (lignée B). Croisement (AxB) => souris « humanisée » 3. Production d’hybridomes après immunisation 4. Clonage de l’AcM humain et expression dans des cellules eucaryotes (CHO, NSO …)

28 Immunogénicité des Ac recombinants
Ac chimériques: Dépend de l’Ac chimérique: pas, peu ou fortement immunogène (Homologie plus ou moins forte avec les VH/V humains?) 2. Ac humanisés: Peu immunogène mais dépend également de l’Ac considéré Pour tous les Ac recombinants: Rôle de la voie d’injection? Rôle des doses injectées et de leur nombre/fréquence? Rôle de l’antigène ciblé? Test de détection des HAMA utilisé!

29 Les 27 AcM utilisés en clinique en 2012 (FDA+EMEA)
- 2 AcM sont des IgG de souris (une IgG1, une IgG2a) - 4 AcM sont des IgG1 humaines chimériques - 9 AcM sont des IgG humanisées (dix IgG1 dont deux Fab, deux IgG4, une IgG2/4) - 9 AcM sont des IgG humaines (sept IgG1, deux IgG2) - 1 Ac bi-spécifique (rat IgG2b/souris IgG2a) - 2 Fab (un chimérique PEGylé, un humanisé) * Juin 2012

30 Les AcM utilisés en clinique (FDA+EMEA+ Chine)
33 AcM sont/ont été sur le marché* et ont généré des revenus de près de quarante milliards d’Euros en 2011: - 8 AcM dans les maladies inflammatoires/auto-immunes - 1 AcM dans les maladies infectieuses (VRS) - 3 AcM dans la transplantation - 1 AcM dans les maladies cardio-vasculaires - 1 AcM dans une maladie neuro-dégénérative (SEP) - 1 AcM dans l’asthme allergique - 15 AcM en oncologie - 1 Acm en ophtalmologie (DMLA) - 1 AcM dans les maladies osseuses - 1 AcM en hématologie (HPN) * Juin 2012

31 Quelques règles de lecture à propos des AcM
Nom Type Ex. d’anticorps xxmOmab Mouse muromonab (souris) britumomab xxXImab Chimeric rituximab (chimérique) cetuximab XXZUmab Humanized trastuzumab (humanisé) alemtuzumab XxmUmab Fully Human panitumumab (humain) adalimumab

32 Optimiser les anticorps monoclonaux
*Optimisation de la fixation des AcM et des effets biologiques induits sur la cible : - affinité et avidité - spécificité «fine»: choix de l’épitope (effets pro-apoptotiques, cytostatiques …) *Optimisation des fonctions effectrices : - meilleurs recrutement et activation des cellules effectrices [cellules NK, neutrophiles, monocytes/ macrophages, CTLs (anticorps bispécifiques, «T-bodies»)] - meilleure activation du complément (C1q) (voie classique: IgG3> IgG1, IgG2) => formation du Complexe d’Attaque Membranaire

33 AcM optimisés: les anticorps bispécifiques (BsAb)
Ag cible Cellule effectrice Cellule cible Lyse Phagocytose BsAb Molécule de stimulation (A) Ag cible Cellule cible Lyse BsAb (B) Drogues Cytokines Vecteurs Haptènes bivalents

34 Anticorps bispécifique: 1. Ingénierie cellulaire (quadromes)
(Milstein & Cuello, Nature, 305, , 1983) Fusion Sélection BsAb

35 Anticorps bispécifique: 2
Anticorps bispécifique: 2. Ingénierie biochimique (MDX-260, anti-CD64/anti-GD2) Q représente le N-éthyl succinimidyl; R, le O-phénylène-dissuccinimidyl

36 Anticorps bispécifiques: 3. Ingénierie moléculaire
VH VL Tag Espaceur VLa VHa VLb VHb Fv L rbs Stop Etiquette (GGGGS)3 P scFv “Diabody” bivalent “Diabody” bispécifique

37 Génération et ingénierie de fragments d’Ac
1989: Isolement de domaines VH ayant de fortes affinités à partir de banques de domaines VH exprimés dans E. coli (Ward et al, Nature, 341:544) 1993: Ac intracellulaires (“Intrabodies”) (Marasco et al, PNAS, 90:7889) et fragments Fc à usage thérapeutique (Debré et al, Lancet, 342:945) 1993: Ingénierie moléculaire de formats bispécifiques: “diabodies” (Holliger et al, PNAS, 90:6444), “triabodies”…. 1993: Découverte d’Ac de Camelidæ dépourvus de chaînes légères (Hamers-Casterman et al, Nature, 363:446) 2008: Régression tumorale chez des patients cancéreux après injection de très faibles doses de fragments d’Ac bispécifiques (Bargou et al, Science, 321:974)

38 Expression de «single chain Fv  (scFv)» à la surface de cellules de mammifères
Espaceur VHa VLa L Tag (GGGGS)3 P/O Stop TM ± région IC Expression (« Hooking ») Expression + transduction (« T-bodies ») scFv-TM-IC TM ± IC

39 Anticorps bispécifique de lama VHH: ciblage du RFcIII/CD16 et d’un antigène associé aux tumeurs (ACE) VHH (anti-ACE) - huC VHH (anti-RFcIII) - huCH1 Fab-like (bispécifique) VHH Ab bispécifique Cellule NK ACE Cellule tumorale RFcIII

40 Utilisation de fragments scFv comme «intrabodies»
VHa VLa Espaceur Tag scFv L’expression intracellulaire d’un scFv anti-ras neutralisant à l’aide d’un vecteur viral induit la régression tumorale dans des souris nude (HCT 116)

41 Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)

42 Fonctions effectrices des IgG dépendantes des récepteurs pour la région Fc des IgG (RFc)
* Fixation aux RFc activateurs (I, IIA, III): * La cytotoxicité dépendante d’anticorps (ADCC)(cellules NK, monocytes, neutrophiles) * La phagocytose de particules opsonisée (DC, (macrophages) * L’endocytose de complexes immuns (monocytes, DC, macrophages, neutrophiles, lymphocytes B) * La sécrétion de cytokines et chimiokines * Fixation aux RFc inhibiteurs (IIB) : blocage de l’activation cellulaire induite par d’autres récepteurs (BCR, RFc, RFc activateurs…) (lymphocytes B, mastocytes, monocytes…)

43 Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)
Stratégies d’ingénierie de la région Fc : 1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1 ayant une région Fc mutée 2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1

44 Sélection de mutants IgG1 ayant une fixation accrue au RFcIIIA et présentant une plus forte ADCC
Stratégie: mutagenèse dirigée de tous les acides aminés exposés aux solvants dans les domaines CH2 et CH3 d’une IgG1 humaine (anti-HER2/Neu, trastuzumab) Mutants >WT ( FcRIIIA binding)* T256A K290A S298A E333A K334A A339T S298A/E333A S298A/K334A S298A/E333A/K334A * Numérotation «Eu» (Shields et al., J. Biol. Chem., 2001) WT AICC

45 Anticorps monoclonaux optimisés: ingénierie de la région Fc (IgG1)
Stratégies d’ingénierie de la région Fc : 1. Criblage et sélection d’anticorps IgG1 ayant une région Fc mutée 2. Modification de la glycosylation de la région Fc des anticorps IgG1

46 Hétérogénéité de la glycosylation des AcM
Glc NAc Mannose Galactose Fucose 1,6 NeuAc 2,6 m/z Cpm G0 G1 G1F G2F (courtesy of L. Krummen, Genentech, Inc., USA)

47 Ingénierie de la glycosylation (IgG1 humaines)
L’absence de fucose ou un contenu faible en fucose (20-35%), La présence de galactose et/ou de galactose et d’acide sialique à l’extrémité de/des GlcNAc terminales, La présence d’une GlcNAc intercalaire, accroissent la fixation aux RFc et augmente l’ADCC des IgG1 monoclonales humaines

48 Les anticorps monoclonaux optimisés
* Optimisation des propriétés pharmaco-cinétiques * Meilleure bio-distribution et ciblage (notamment au site de la tumeur) * Meilleure capture de drogues, vecteurs viraux, et haptènes radio-marqués au voisinage de la cellule-cible (dans la plupart des cas, des cellules tumorales)

49 Les nouveaux défis des anticorps monoclonaux
Un, deux, trois AcM (bio-terrorisme, oncologie…)? - Les anticorps conjugués aux drogues (immunoconjugués): le grand retour de la “magic bullet”? Les nouveaux formats (Ac bi- ou tri-spécifiques, simples domaines VH, VHH…? Nouvelles utilisations: anticorps intra-cellulaires, fragment d’Ac à la surface de cellules effectrices (« T-bodies ») ou cibles (« Hooking »): AcM et thérapie cellulaire? Qu’est ce qu’un biosimilaire?!

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