Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central Lahouari AMAR LGN - UMR 7091 sous la direction.

Présentation au sujet: "Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central Lahouari AMAR LGN - UMR 7091 sous la direction."— Transcription de la présentation:

1 Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central Lahouari AMAR LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur Jacques MALLET

2 Le transfert de gène dans le SNC
Les vecteurs lentiviraux - caractéristiques - avantages et méthode de production - applications Résultats Développement d’un seul vecteur lentiviral pour: 1) l’expression régulée d’un facteur protéique 2) l’expression régulée de shARN Conclusion générale et perspectives

3 Transfert de gène dans le SNC
In vivo Gène thérapeutique: protéine ou séquence nucléotidique (siARN) Ex vivo Cellules transduites

4 Spécificités du système nerveux central relatives au transfert de gène
Présence de la barrière hématoencéphalique Limite le passage de molécules thérapeutiques Nécessité du transfert de gène… La majorité des cellules du SN sont quiescentes Possibilité d’utilisation de vecteurs intégratifs ou épisomaux Vecteurs non viraux peu efficaces à long terme préférentiellement viral… Diversité cellulaire Nécessité d’expression restreinte ou élargie du facteur thérapeutique Possibilité  de ciblage d’une structure ou noyau particulier dans le SN Transport rétrograde ou antérograde dans les neurones avec un vecteur dont le tropisme est modulable. Vecteurs lentiviraux particulièrement adaptés

5 Avantages des vecteurs lentiviraux
Transduction des cellules quiescentes et en division Expression stable et à long terme du transgène dans le SNC Faible toxicité Facilité de production à haut titre dénuée de RCR Pseudotypage aisé

6 Vecteurs lentiviraux : méthode de production
Plasmide transcomplémentant PhCMV pA gag Pro pol Ψ rev tat VSV-G PhCMV pA Plasmide d’enveloppe Plasmide vecteur 5’LTR 3’LTR RRE cPPT Pro Transgène U3 PPT Ψ WPRE Particules virales pseudotypées avec la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G)

7 Applications des vecteurs lentiviraux
Thérapie génique Production d’animaux transgéniques (modèles de maladies…) Etude de fonction de gènes (surexpression ou inhibition par siARN)

8 Nécessité d’un système régulable
Etudes cliniques Moduler l’expression du facteur thérapeutique Arrêt du traitement en cas de complication grave Etudes fondamentales Contrôle temporel du transgène Contrôle du niveau d’expression

9 Le système de régulation inductible par la Tetracycline (Tet-on)
PGK rTetR VP16 rtTA Tet + rTetR VP16 7TetO CMVmin Transgène 7TetO CMVmin Transgène

10 1. Développement d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée d’une protéine thérapeutique

11 Nécessité d’un vecteur unique
Réduction de la quantité de vecteur administrée: Réduction du risque de mutagenèse insertionnelle Réduction du risque d’immunogénicité lié au vecteur Permettre l’expression du transgène et du transactivateur dans la même cellule

12 Un vecteur lentiviral unique pour l’expression régulée d’un transgène
5’LTR 3’LTR cPPT Pcmv min Transgène U3 PPT Ψ WPRE Ins Stuffer PPGK rtTA2-M2 BGH polyA Luciférase - Tyrosine hydroxylase

13 Expression régulée de la luciférase in vitro
Transduction d’une culture primaire d’astrocytes + Dox - Dox

14 Réversibilité in vitro
Effet de la doxycycline sur l’activité luciférase Cinétique d’induction in vitro Réversibilité in vitro Dose optimale in vitro

15 Injection du vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la luciférase dans le striatum de rat
+ Dox - Dox

16 Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase
Evaluation in vitro + Dox - Dox

17 Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase
Evaluation in vivo + Dox - Dox Contrôle non injecté

18 Résumé Construction d’un seul vecteur lentiviral portant un système de régulation Tet-on Validation in vitro et in vivo Niveau d’induction fort Fuite non détectable en absence d’inducteur Dose d’inducteur élevée in vivo

19 Applications, limites et voies d’amélioration
Application de ce vecteur Tet-on Utilisation in vitro Utilisation chez l’animal Exemple : stratégie de neuroprotection Limites dans une stratégie de remplacement? Utilisation en clinique exclue Nombre faible de cellules exprimant le transgène in vivo après induction Quantité de vecteur utilisée sous optimale Défaut de retrotranscription d’un génome vecteur long Co-expression du transactivateur et du transgène Un vecteur versus deux vecteurs?

20 2. Développement d’un seul vecteur lentiviral permettant l’expression régulée de shARN

21 L’ARN interférence

22 Expression des siARN

23 Un promoteur d’ARN Polymérase III Le promoteur U6
L’expression des shARN nécessite l’utilisation d’un promoteur d’ARN polymérase III Débute la transcription à un nucléotide défini (G) Arrêt de la transcription par 5 thymidines Pol III +1 Site de démarrage de la transcription SNAPc TBP STAF1 Oct1 -24 -29 -47 -66 -149 -244 ESD ESP TATA shARN TTTTT G core

24 Stratégie négative : encombrement stérique inductible d’un promoteur polymérase III
Sans inducteur : inhibition de la synthèse des siARN ESD ESP shARN TATA Protéine Pol III SNAPc TBP Avec inducteur : synthèse des siARN inducteur Pol III ESD ESP shARN TATA SNAPc TBP

25 Encombrement stérique inductible du promoteur U6 par le système tétracycline
Sans Doxycycline : inhibition de la synthèse des siARN shARN ESD ESP Tet0 TATA répresseur Tet Pol III TBP SNAPc Avec Doxycycline : synthèse des siARN Pol III ESD ESP shARN TATA TetO SNAPc TBP doxycycline

26 Un promoteur U6 régulable : Stratégie négative
ESD TATA +1 -24 -29 -47 -66 -149 -244 ESP ESD ESP TetO TATA ESD ESP TetO TATA ESD ESP TetO TATA ESD ESP TetO TATA ESD ESP TetO TATA ESD ESP TetO TATA

27 Inhibition de l ’expression de la GFP dans des cellules HEK 293T-GFP
% de cellules GFP positives

28 Utilisation d’un transactivateur de l’ARN polymerase III
Stratégie positive : adaptation du système Tet-on à un promoteur d’ARN polymérase III Utilisation d’un transactivateur de l’ARN polymerase III Utilisation d’un promoteur polymérase III minimal inductible par la tétracycline

29 Développement d’un transactivateur de promoteur polymérase III inductible par la doxycycline
Un nouveau transactivateur rtTA-Oct2 rtTA Domaine transactivateur Q18III(QA) VP16 Domaine transactivateur VP16 du virus HSV Domaine de liaison à l’ADN du rtTA2-M2

30 Développement d’un promoteur U6 minimal inductible par la doxycycline
Un nouveau promoteur 7 TetO DSE ESP Boîte TATA

31 Un promoteur d’ARN Polymérase III inductible par la doxycycline
Oct-2 rtTA Dox Pol III TBP SNAPc +1 sens boucle antisens TTTTT 19 pb 9 pb 7 TetO ESP Boîte TATA antisens sens 5’ UU shARN

32 Un vecteur lentiviral pour l’expression régulée de shARN dirigé contre la GFP
5’LTR 3’LTR cPPT U3 PPT Ψ PPGK rtTA-Oct2 WPRE PU6 min shGFP - dox Pas d’expression de shGFP Synthèse de la GFP Expression de shGFP Inhibition de la GFP + dox

33 Une expression de shGFP régulée
+ Dox - Dox Northern Blot Transduction de cellules HEK293T-GFP avec différentes quantités de vecteur lentiviral exprimant de façon régulée un shGFP

34 Expression de shGFP en fonction de la concentration de doxycycline

35 Cinétique d’expression du shARN
- Dox + Dox + Dox - Dox

36 Application du système pour la régulation d’un gène endogène : p53
HEK293T MCF-7 A549

37 Résumé Construction d’un système de régulation qui permet une expression contrôlée par la doxycycline de shARN Validation du contrôle d’un gène endogène Forte inductibilité Système réversible Forte concentration de doxycycline

38 Limites et perspectives
Dose de doxycycline Validation in vivo Expression de shARN par promoteur pol III versus promoteur pol II

39 Conclusion générale Construction d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée par le système Tet-on d’une protéine thérapeutique. Développement d’un système de régulation de l’expression de shARN inductible par la tétracycline et sa vectorisation. Problème de l’immunogénicité du transactivateur pour utilisation clinique

40 Perspectives pour une utilisation clinique
Se tourner vers un système de régulation d’origine humaine ou « humanisé » pour la clinique Rapamycine ZFP synthétique Régulation Physiologique La régulation en cas de complication Alternatives :excision du vecteur ou suicide des cellules transduites